История
История
Содержание статьи:
В третьей части заключительного в 2021 г. вебинара «Биотехнология: контроль качества биотехнологических препаратов», состоявшегося 9 декабря 2021 г. в рамках «Онлайн-лектория Диаэм», в лекции Владимира Языкова (ThermoFS) рассмотрены возможности применения спектрофотометрии в контроле качества биофармацевтических препаратов на примере продукции NanoDrop от ThermoFS.
Продукция NanoDrop служит для оценки анализа проб и результатов, получающихся при выделении ДНК, РНК или протеина из источников – клеток или тканей – экстрагированием и в ходе дальнейшей пробоподготовки.(Рис. 1)
Оценка подготовки проб – ключевой шаг на нескольких этапах многих рабочих процессов в биологии.
Но, наверно, все исследователи знают, что именно пробоподготовка является самым трудозатратным процессом. Чтобы облегчить его оценку, ThermoFS занимается разработкой продуктов и сложных алгоритмов, помогающих упростить эту работу. В частности, NanoDrop дает оценку качеству пробоподготовки. Более точная оценка на каждом этапе – это ключевой момент, который экономит пользователю средства, чтобы не возвращаться на круг «выделение, экстракция, пробоподготовка». Ведь все это требует затрат времени, а значит, и денег.
NanoDropLite: измеряет только ДНК, РНК и очищенный белок на 260 и 280 нм, является базовым инструментом, рассчитан на одну пробу.
NanoDropOne/OneC – применяется для количественного анализа ДНК, РНК и белков, основан на абсорбции, работает с полным спектром, рассчитан на одну пробу, использует протокол Acclaro и софт Security Software: 21 CFR part 11 compliance. Модель с индексом «С» включает кювету.
NanoDrop Eight применяется для количественного анализа ДНК, РНК и белков, основан на абсорбции, работает с полным спектром, сразу работает с количеством проб до 8, требует подключения к ПК, использует протокол Acclaro.
Младшая модель этого семейства фотометров измеряет только, ДНК, РНК и белок в диапазонах 260 нм и 280 нм. Это базовый инструмент линейки, рассчитанный на одну пробу.
Компактный дизайн этого прибора рассчитан на ограниченный бюджет. Он разработан для рутинных измерений ДНК, РНК и протеинов. Измерения осуществляются стандартно в диапазонах 260 нм и 280 нм; в приборе используются кремниевые светодиоды (классические LED). Нуклеиновые кислоты он измеряет на 260 нм, 260/280 нм с коэффициентом чистоты, очищенные протеины – на 280 нм в указанном динамическом диапазоне (4 – 1,500 нг/мкл по двухцепочечной ДНК и 0.12 мг/мл – 45 мг/мл по бычьему сывороточному альбумину).
До 500 измерений прибор хранит на борту и экспортирует в *.csv файлы через USB устройства. Все достаточно стандартно: ничего больше, ничего меньше.
Доступна эта же модель с индексом PR (ND-LITE-PR) – в нее входит принтер для криогенных этикеток.
Этот прибор относится к типу stand-alone – полностью индивидуальный, снабжен экранчиком, управляется без подключения компьютера, все можно сделать прямо на приборе.
NanoDrop Lite служит для определения нуклеиновых кислот и очищенного белка и подходит тем, кому не хватает средств на собственный NanoDrop One, но нужен свой независимый инструмент, чтобы не обращаться к сторонним лабораториям, располагающим своими NanoDrop более высокой категории. Он создан для тех, кому требуется свой портативный инструмент: традиционных пользователей обычных спектрофотометров для неких рутинных задач, исследователей, которым нужен маленький инструмент в суровых условиях (в полевых лабораториях, на передвижных станциях и везде, где необходимо постоянно замерять качество проб).
Это флагманские устройства рассматриваемой линейки приборов. Индекс «С» обозначает кюветный порт – то есть можно работать на этом приборе с летучими пробами, брать больший объем для анализа и анализировать в кювете. А на пьедестале можно исследовать микроколичества – 1-2 мкл, каплю.
Эти приборы позволяют провести количественный анализ ДНК, РНК и протеинов, в них использована классическая абсорбция, производится сканирование полного спектрального диапазона, рассчитаны они на одну пробу.
Вероятно, можно назвать эти приборы самыми востребованными на рынке по всему миру, причем не только среди продукции ThermoFS. Производятся они в США, а не по лицензии в странах Азии – и это подразумевает особую ответственность за качество.
Для тех, кто работает с ДНК, РНК и белком, здесь по анализу проб вроде бы не возникает ничего нового. Уровень точности, надежности и эргономичности NanoDrop One позволяет задействовать их там, где качество полученной пробы играет критическую роль при определении успеха/неудачи последующих этапов – чтобы не возвращаться к длительному процессу пробоподготовки, не тратить дополнительные реагенты на очередную очистку нуклеиновых кислот и дальнейшее выделение исследуемого материала.
NanoDrop OneC позволяет работать и с кюветой, и с пьедесталом. Он очень удобен для реализации метода OD 600, который используется для определения концентрации культур микробных клеток в растворе путем измерения рассеянного света при 600 нм. Также он подходит для экспериментов по изучению кинетики и для работы с летучими растворителями.
Управляются приборы этой серии с помощью сенсорного экрана высокого разрешения. Все приложения и процессы хорошо визуализируются; у прибора великолепная эргономика: экран можно сдвинуть влево или вправо, в зависимости от того, левша или правша им управляет. С ним можно работать в перчатках, поскольку экран характеризуется прекрасной чувствительностью и быстродействием.
Это оборудование имеет все современные подключения: WiFi, bluetooth, USB порты, принтеры. Можно пользоваться им стационарно или с компьютером, в том числе с подключением к облачному сервису ThermoFisher Cloud – как удобно пользователю.
В июле 2020 г. программное обеспечение по приборам NanoDrop было обновлено. Это классический стандартный софт, который скачивается бесплатно с сайта, инсталлируется на компьютер и обновляется. В нем можно смотреть свою информацию, анализировать данные, создавать графики.
Классические первые версии этого софта v1.X подразумевали, что компьютер необходим только для просмотра информации, а управление прибором осуществлялось стационарно. В версии v2.0 появилась возможность полноценного использования компьютера, включая не только управление прибором, но и создание аккаунтов на Windows.
А за отдельную опциональную плату в приборах, начиная с линейки NanoDrop One, доступно еще и использование защитного программного протокола 21 CFR part 11 compliance. Это стандартное программное обеспечение, которое, как и сам протокол, требуют в основном крупные биотехнологические компании, фармацевтические гиганты, в которых надо четко прослеживать либо ограничивать доступ или пользоваться индивидуальными аккаунтами.
Все модели, начиная с флагманских NanoDrop One, имеют алгоритм Acclaro.
Acclaro – аппаратно-программная функция приборов, определяющая уровень загрязнения в пробах с использованием современных мощных алгоритмов оценки данных. Алгоритм Acclaro определяет наличие загрязнений в пробе на основе анализа данных, предоставляет техподдержку по запросу и устраняет неполадки – как технические, так и аппликационные. Все это требует подключения к интернету: тогда и определяются ошибки, и отправляется информация о них в техподдержку. Чистота измерений обеспечивается с помощью датчика и анализа цифрового изображения, в результате чего отслеживаются разбитые столбцы и пузырьки – такова аппаратная часть этой функции.
Acclaro дает пользователю знания о примесях и загрязнениях в пробе, дает правильные результаты, вычитая спектры основных загрязнителей НК и протеинов. Программная часть основана на том, что в программе уже присутствуют заведомо «вшитые» данные об основных загрязнителях, которые встречаются при выделении нуклеиновых кислот и протеинов.
Вот как это выглядит на сенсорном экране приборов серии NanoDrop One.
Acclaro не просто предупреждает о низком уровне чистоты пробы: он включает соответствующую индикацию (оранжевый треугольник или восклицательный знак). Также программная часть выводит пользователю графики оригинальной пробы с загрязнителем, скорректированную концентрацию (на примере это обозначено зеленым цветом в правом верхнем углу слайда, а рыжий график отображает загрязнение, в данном случае протеин).
Пользователь видит на графиках скорректированную концентрацию и оригинальную пробу вместе с загрязнителем.
При анализе двухцепочечной ДНК в качестве контаминантов чаще всего выступают протеины, фенол, гуанидин гидрохлорид, гуанидин тиоцианат и гуанидин изотиоцианат.
На иллюстрации все показано в расширенном виде: концентрация фенола, результат корректировки данных и исправления концентрации, предоставленные Acclaro, указанный процент ошибки.
Это все дается исследователю, который на основании таких данных принимает решение, возвращаться ли ему к пробоподготовке заново, тратить дополнительно время, средства, какие-то расходные материалы, если он использует систему KingFisher, или все-таки довольствоваться полученными результатами и идти дальше.
Вот пример того, как Acclaro определяет загрязнения.
Большинство наборов по выделению нуклеиновых кислот содержат гуанидин тиоцианат и гуанидин гидрохлорид. Гуанидин тиоцианат не изменяет оптической плотности в диапазоне 260 нм, но может ингибировать реакцию ПЦР за счет денатурирования полимераз. Acclaro определит тиоцианат в образцах РНК и покажет скорректированную концентрацию, а также процент загрязнений.
Вот как это работает – и вот почему на рынке ThermoFS доминирует в плане продаж таких капельных спектрофотометров УФ-видимого спектра для анализа микрообразцов.
Это новая модель от Thermo FS, пришедшая на замену устройству NanoDrop 8000 и забравший все самые лучшие функции у NanoDrop One: протокол Acclaro, защитное программное обеспечение с протоколом 21 CFR и многие другие функции, такие как повышенная чувствительность, воспроизводимость и скорость работы.
Он рассчитан также на количественный анализ нуклеиновых кислот и протеинов, работает по принципу абсорбции и сканирования полного УФ-видимого диапазона, позволяет анализировать до восьми проб. Для работы с прибором и интерпретации результатов требуется ноутбук или стандартный компьютер.
NanoDrop Eight разработан для молекулярно-генетических, генетических, молекулярно-диагностических, фармацевтических и биотехнологических лабораторий с высокой пропускной нагрузкой, рассчитан на одну или восемь проб, производит сканирование полного УФ-видимого спетрального диапазона (190-850 нм), работает в динамическом диапазоне 2 – 10000 нг/мл по двухцепочечной ДНК и 0.15 – 300 мг/мл по БСА.
NanoDrop 8000, он же Eight, который пришел на замену 8000-му, обеспечивает сканирование полного УФ-видимого спектрального диапазона, также предназначен для измерения в основном нуклеиновых кислот и протеинов, в большей степени даже для протеиновых лабораторий совместно с другими исследованиями проб по светопоглощению/абсорбции. Также можно обеспечить на нем колориметрию белков.
Раскапывание в нем осуществляется посредством восьмиканальной пипетки. Одноканальную использовать не рекомендуется, потому что пробы испаряются и это влияет на качество результата.
Это прибор для тех, кто обрабатывает более 20 образцов и кому нужна скорость обработки данных на высоком потоке. Например, 8 проб раскапываются менее 20 секунд, а 96-луночный планшет можно раскапать и проанализировать(!) примерно за 6 минут. Это хорошая альтернатива планшетным ридерам для работы с маленькими объемами проб в большом количестве.
Он снабжен алгоритмом Acclaro, что дает большое преимущество этому прибору по сравнению с планшетными ридерами, поскольку он предоставляет пользователю знания о загрязнителях проб.
Сканирование спектрального диапазона у него улучшено по сравнению с предшествующей моделью и расширено: теперь он сканирует от 190 до 850 нм с шагом примерно 1 нм (у предшественника был диапазон 220-750 нм).
Главные усовершенствования NanoDrop 8000: длины оптического пути не только 1 мм и 0.2 мм, но и 0.1 мм, максимальные концентрации ДНК (РНК) – 10000 (8000) нг/мкл вместо прежних 3750 (3000) нг/мкл, БСА (IgG) – 400 (145) мг/мл вместо 100 (50) мг/мл, оптический диапазон 190 – 850 нм вместо 220 – 750 нм.
Улучшен также динамический диапазон определения по двухспиральной ДНК и бычьему сывороточному альбумину. Оценка качества пробы улучшилась, чувствительность повысилась, выросли и скорости измерения – 8 проб в 20 с и даже еще быстрее.(Рис. 2)
Для работы с этим прибором требуется персональный компьютер.
Следует остановиться на аппаратной части приборов. Они служат для проверки правильности работы. Проводится оценка воспроизводимости: прибор, когда его включают, сначала проверяет и подтверждает точность в определенных точках по длине пути пьедестала. При закрытом пьедестале он измеряет диапазон движения самого пьедестала на длинах 1 мм, 0.2 мм. 0.1 мм, 0.05 мм и 0.03 мм.
Далее проводится проверка светоинтенсивности. Прибор начинает мерцать, пьедестал начинает мерцать, подтверждается точность измерения длины волны прибора, ищутся известные пики в ксеноновом спектре.
Сам Acclaro, рассмотренный выше, аппаратным образом проверяет столбцы и пузырьки в пробе, а также проверяет пьедестал на ошибки в аппаратной части.
Большие биотехнологические и фармацевтические компании в основном приобретают прибор сразу с протоколами IQ/OQ и PQ. Его инсталлирует инженер, которому нужно для этого выехать на место. Этот протокол опциональный, поставляется по требованию пользователя.
Стоит отметить: у данной линейки приборов расходных материалов почти нет.
Следует упомянуть набор Performance Verification (PV-1) для проверки правильности воспроизводимости NanoDrop One/OneC.
Это новинка: она представляет собой ампулу с раствором никотиновой кислоты для NanoDrop One. Такой Performance Verification необходимо использовать 1-2 раза в год, не чаще. Это использование – не калибровка прибора, а внутренний контроль качества, производимый самим пользователем. Применение этого реактива является хорошей лабораторной практикой. В 99,7% случаев приборы проходят такую проверку. Но если случилось нечто и прибор ее не прошел, то нужно отправить его на калибровку в квалифицированный сервисный центр, обратившись к дистрибьютору ThermoFS и сообщив о зафиксированной неполадке. После этого специалисты сервиса выяснят причину сбоя, проверят все диагностические модули и работу прибора на правильность, пригодность его к анализу и возвратят прибор пользователю – или сервисный отдел примет решение о каких-то заменах и прочих действиях.
Для всех остальных серий данного оборудования есть CF-1 – это раствор бихромата калия, который продолжает использоваться для оценки воспроизводимости предыдущих моделей серий One (2000-2000С) и для NanoDrop 8000 и NanoDrop Lite.
Есть расходные материалы и наборы, которые можно приобрести отдельно для NanoDrop One.
NanoDrop One поставляются с двумя годами гарантии. Это очень важно: NanoDrop Lite подразумевает один год гарантии, флагманские модели – два, NanoDrop Eight или 8000 – необходимо уточнять, возможны и два года гарантии.
Все приборы NanoDrop включают поставку, гарантийные обязательства, наборы для оценки воспроизводимости, инициации пьедестала Pedestal Reconditioning, USB накопитель и салфетка для ухода за экраном.
Отдельно можно купить наборы ND-PP1 Productivity Kit, включающие одноканальную пипетку, подставку для носиков, сами носики, набор PV1, набор Pedestal Reconditioning, салфетку, флешкарту, стикер «I Love My NanoDrop», который удобно куда-то приклеить, например, на ноутбук.
Набор с индексом «С» используется для Nano Drop с индексом «С» – там есть еще микромешалки и кварцевая кювета.
Стоит обратить внимание, что NanoDrop с индексом «С» имеет отделение для кюветы, нагреваемое до 37 градусов – своеобразным инкубированием – и функцией перемешивания в кювете. Это очень важно, потому что об этом нигде не упоминается. Микромешалки предназначены как раз для этой функции.
У пользователей нередко возникает вопрос, чем лучше очищать пьедестал. Основной принцип: нужно применять средства, которые не вредят нуклеиновым кислотам и белкам. Многие используют для этих целей безворсовую салфетку (например, для оптики), кто-то пользуется органическими растворителями, используют и фильтровальную бумагу. Можно капнуть каплю обычной воды (дистиллята, деионизованной воды), когда снимается сигнал с пустой пробы (blank), подержать на пьедестале несколько минут и протереть насухо, а затем повторить снятие сигнала с пустой пробы.
ThermoFS предлагает расходные материалы с флуоресцентными красителями, которые позволяют различать типы нуклеиновых кислот, измерять их концентрацию РНК, одноцепочечной и двухцепочечной ДНК и протеинов.
Это карманный прибор Qubit – он дает очень высокую точность, потому что этот флуориметр закрытый по своим расходным материалам.
Fluoroscan – полностью открытый прибор, он идет как ридер для планшетного формата.
Комбайн Varioskan LUX, а также Fluoroscan FL (Fluoroskan FL) – иллюминометр и флуориметр в одном корпусе. Такие комбайны открывают широкие возможности от классической фотометрии до экзотических ее видов вроде флуоресценции во времени, всякие FRET, BRET и так далее.
Для того, чтобы различить типы нуклеиновых кислот, белков, а также для оценки чистоты образца используют приборы семейства NanoDrop, а также Multiskan SkyHigh и Varioskan LUX.
Приборы можно купить и сэкономить. Например, в паре можно использовать NanoDrop и, допустим, Qubit. Для чего?
Сравнительные тесты показывают сопоставимость точности данных фотометрии с Acclaro и флуоресценции.
Флуоресценция дает повышенную чувствительность, так как она в тысячу раз лучше и чувствительнее, чем классическая фотометрия.
Недостатки состоят в том, что такой прибор рассчитан на свои расходные материалы, чтобы по двум точкам посмотреть, куда ложится концентрация исследуемого образца, соответственно, к ним поставляются стандарты.
Ключевым дополнением в таком случае будет NanoDrop с функцией Acclaro. Флуоресценция как чувствительный метод позволит очень точно определить концентрацию, но не даст сведений о загрязнителях в пробе.
Но информацию о типе загрязнений и степени чистоты пробы дает алгоритм Аккларо в приборах NanoDrop One или Eight. Приборы оценивают все быстро, они абсолютно открыты, не требуют никаких расходных материалов – и в этом их ключевые преимущества.
Когда два этих устройства работают в паре, пользователь получает не только очень точные концентрации, но и возможность быстро оценить степень загрязнения.
Можно дать некие общие рекомендации, основанные на потоке проб, проходящем через лабораторию. Например, под низкий поток (менее 10-15 образцов ДНК/РНК) можно использовать флуориметр Qubit 4 под одну пробу. Для повышенного потока (10-50 образцов нуклеиновых кислот) пригодится Qubit Flex на восемь проб. Для высокопотоковых (более 50 образцов ДНК/РНК) лабораторий есть свое решение, позволяющее смотреть пробы на стрипах, пластике 96-, 384- и 1500-луночном – Fluoroscan, Varioskan LUX.
Все это предлагает ThermoFS. Кроме того, у компании есть широчайшее предложение по лабораторному пластику, в том числе бренду Nunc и другим – под различные виды флуориметрии, люминометрии. Под разнообразные клиентские задачи можно подобрать планшеты, красители и расходные материалы с брендом ThermoFS.
Компания не просто дает клиенту что-то одно, а обеспечивает полностью решение – от маленьких пробников и расходных материалов, наборов по определению пролиферации, концентрации, пластика под различные задачи, и до обслуживания, научно-методической поддержки, предоставляемой круглосуточно на русском языке. Клиент приобретает полное решение, в рамках которого может быстро получить консультации по своим запросам.
Нам кажется, что это очень важно – и немногие компании стремятся к этому должным образом так же, как это делает ThermoFS.
Вопросы можно задать по телефону +7 (916) 744-6559 или электронной почте Vladimir.Yazykov@thermofisher.com.
Ссылки на остальные части вебинара:
Новость о вебинаре «Биотехнология: одноразовые и классические технологии в масштабировании и производстве»
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
