История
История
Содержание статьи:
Это вторая часть заключительного в 2021 г. вебинара «Биотехнология: контроль качества биотехнологических препаратов», состоявшегося 9 декабря 2021 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм». В рамках этой лекции Романа Романова (представителя компании Bio-Rad) рассмотрено применение цифровой ПЦР для контроля присутствия остаточной ДНК в фармацевтической продукции на примере систем цифровой ПЦР Bio-Rad, используемых для контроля качества в фармацевтической технологии. Лекция содержит обзор систем с описанием их преимуществ, особенностей и производительности.
Известно, что биофармацевтические препараты – в частности, вакцины – часто производятся методом рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих, бактерий, дрожжей и других организмов, которые неизбежно оставляют свою ДНК в продуктах жизнедеятельности.
По современным требованиям качественный и безопасный биофармацевтический препарат не должен содержать практически ничего кроме основного действующего вещества. Не должен он содержать и геномы и ДНК клеток хозяина, что достаточно сложно реализовать и проконтролировать.
Сейчас действует достаточно большое количество стандартов – как европейских, так и международных, и американских, которые регламентируют количество остаточной ДНК в конечном продукте. Практически все уважающие себя компании стремятся привести свои продукты к этим стандартам. Поэтому тесты на остаточную ДНК проводятся на разных стадиях производства.
И для всех из них установлены довольно жесткие требования – достаточно маленькие количества, пико- и нанограммы; соответствовать им и контролировать их достаточно сложно.
Это можно делать на всех ступенях, начиная от исходных реагентов и культур клеток, стадиях выделения белков и при крупнотоннажном выходе, при лиофилизации и упаковке, а также на стадии полностью готового продукта.
Все стадии производственного процесса можно разделить в соответствии с такой диаграммой условно: на движение от исходных реагентов к конечным продуктам. Конечно, и в том, и в другом нужно контролировать количество остаточной ДНК или примесной ДНК, если она там есть. Но есть и другие области, в которых это может быть полезно для понимания процесса производства, его сильных и слабых сторон:
На всех этих стадиях возможно накопление примесного продукта в целевом, и хотелось бы понимать, как эту концентрацию минимизировать.
Для этого сейчас применяется такой замечательный метод как цПЦР, который на рынке существует давно, но тем не менее для него часто находят все новые применения, которых раньше не было.
Метод использует микрофлюидный подход. На слайде ниже изображено «сердце» микрофлюидного чипа – это несколько очень тонких стеклянных капилляров, собранных на одной подложке: в них формируется микро-, наноэмульсия с помощью капель. Есть одна среда – вот эти гидрофильные капли, и есть гидрофобная среда – фактически масло. Система подбирается таким образом, чтобы получалось равномерное количество капель и эти капли были одинаковыми по всем свойствам, по размерам, и постоянно выделялись в какую-то среду, где с ними потом что-то происходит.
Принципиальная схема цПЦР: создание капель, ПЦР и детекция ее сигнала в каждой капле, а затем подсчет результатов.
Собственно, зачем это для ПЦР? Можно задать такие условия – и, собственно, компания занимается разработкой таких методик – при которых в каждую каплю попадает в среднем (подчеркнуто автором!) одна молекула исходной ДНК, ДНК-мишени. Это на современном уровне развития технологий можно сделать: настроить размер капель достаточно просто с помощью приемов микрофлюидики.
Дальше эти капли попадают в оборудование для амплификации на чипе, в котором эти капли иммобилизованы так, что каждая попадает в одну ячейку. А ячеек много, их может быть 20-30 тысяч. Вся проба оказывается разобранной на отдельные капли – на отдельные ячейки, в среднем по одной копии искомой ДНК в каждой.
После этого чип помещается в амплификатор, где проходит стандартный цикл амплификации, ничем не отличающийся от обычной ПЦР или реалтайм-ПЦР.
Как только амплификация прошла, чип загружается в детектор – простое устройство для считывания сигнала флуоресценции с ячеек (а флуоресцентные метки добавлены в мастер-микс). Пользователь может увидеть, в скольких ячейках произошла реакция ПЦР, то есть амплификация, и это детекция по конечной точке, а не в реальном времени, что важно понимать. В конце пользователь получает ответ на вопрос о том, сколько было копий искомых ДНК в смеси – то есть абсолютную количественную оценку. Делается это именно за счет избыточности, множественности выборки реакции, которая протекает в процессе.
Если стандартная реалтайм-ПЦР работает как непосредственное накопление интегрального сигнала со всей пробы, то цПЦР работает как разбиение целого сигнала на много маленьких сигналов. Они детектируются в конечной точке независимо, и потом распределение активных ячеек, в которых реакция прошла, соотносится с общим количеством этих ячеек – так можно рассчитать, сколько было молекул в исходной смеси.
Собственно, данная технология позволяет внести в метод ряд преимуществ, которые принципиально недостижимы для реалтайм-детекции.
Можно детектировать следовые количества ДНК, тогда когда в реалтайм-ПЦР нужно слишком много циклов или из-за, допустим, фрагментированности мишени плохо происходит отжиг праймеров и тогда вообще не идет реакция, что часто бывает.
Пользователю может быть не нужно выделение нуклеиновых кислот из смеси – что очень важно, поскольку часто смеси нуклеиновых кислот бывают очень сложно устроены и выделить из этой смеси какую-то фракцию, которая нужна исследователю, бывает затруднительным и не очень эффективным.
Представим, что 30 тыс. молекул ДНК попадают в 30 тысяч ячеек – в каждую по одной молекуле. Если в смеси присутствует 300 молекул ингибитора в смеси – это довольно реалистичное соотношение, так действительно бывает – его мало, но он будет ингибировать большое количество реакций, если все молекулы находятся в одной реакционной среде, если реакция запущена вместе.
Если же реакционная смесь разобрана на 30 тысяч ячеек, то только в 300 ячейках окажется ингибитор, а во всех остальных его не будет – и реакция там будет протекать без помех. Благодаря такой капельной технологии достигается низкий эффект ингибирования, принципиально недостижимый в случае, когда реакция протекает в единой смеси.
С помощью различных методов подтверждены минимальные уровни детекции уже для всех стандартных организмов-продуцентов, таких как E.coli, мыши, клетки млекопитающих, ДНК человека, дрожжей. Эти таблицы доступны у производителей оборудования, можно свободно ими пользоваться.
Все особенности метода делают возможной детекцию до фемтограмма ДНК при наличии ингибитора в смеси.
Справа представлены диаграммы, характеризующие изменение чувствительности и надежности методов реалтайм-ПЦР и цПЦР при последовательных разбавлениях. Можно заметить, что когда чувствительность реалтайм-ПЦР начинает падать, то у цПЦР этот параметр в различных смесях будет оставаться на очень высоком уровне. И это очень ценно для следующих задач, которые мы рассмотрим дальше.
Прежде всего он делает возможным именно прямое количественное определение остаточных ДНК. Этот термин – «прямое определение» – очень важен, потому что если к этому протоколу добавить очень много избыточных стадий, то на каждой из них будут копиться ошибки – и это плохо для контроля качества, поскольку контролируется очень небольшой по амплитуде параметр. Исследователь таким образом получит очень много проблемных ложноотрицательных результатов: сложные громоздкие протоколы очень неудобно применять на потоке, в отличие от исследований, где их применяют очень часто.
Здесь же эта самая пониженная чувствительность цифровой капельной ПЦР к ингибированию приводит к очень важному эффекту – сохранению высокого уровня эффективности, который позволяет пропустить этап выделения ДНК. Это очень удобная концепция, поскольку выделение ДНК – процедура громоздкая и в промышленных масштабах может занимать очень много времени и сил персонала лаборатории контроля качества.
В случае реализации Bio-Rad можно использовать систему для полуавтоматической обработки образцов – она доступна, и это тоже очень удобно на потоках в промышленных масштабах в отделах контроля качества.
Набор можно использовать с автоматической системой QX200 AutoDG.
Также дополнительно есть система с урацил-ДНК-гликозилазой (UNG, Uracil N-glycosylase) для контроля за чистотой процесса сторонним методом.
Сейчас на рынке представлено уже несколько моделей приборов для реализации этой задачи. Самые популярные представлены на слайде – прежде всего это система QX200, которая присутствует на рынке в двух вариантах – с ручной и автоматической генерацией капель.
Именно система с автоматической генерацией капель очень хорошо подходит для решения описываемой в лекции задачи, поскольку она позволяет сильно автоматизировать процесс, убрать влияние оператора на результаты и упростить многие протоколы для того, чтобы параллельно производить исследования образцов с нескольких стадий производства.
Эти приборы, как и все приборы для цПЦР, позволяют проводить абсолютную количественную оценку мишеней и не требуют, что важно, стандартной калибровочной кривой каждый раз при постановке реакции.
При работе с реалтайм-ПЦР нужно на что-то калибровать, потому что это метод относительный: вносится какой-то контрольный образец, несколько контрольных образцов, делается по ним калибровочная кривая реалтайм, а потом с целевым образцом нужно сделать то же самое и сравнить полученные при этом результаты с калибровочной кривой. В итоге определение концентрации образца проводится в сравнении с калибровкой.
В цПЦР такого не требуется: прибор калибруется один раз перед постановкой в стандартных условиях, а дальше можно просто постоянно определять количество целевой ДНК за счет абсолютного подсчета.
Производитель отмечает минимальную вариабельность между повторами, что очень приятно для производств, которые имеют лаборатории в нескольких местах –можно таким образом сравнивать, валидировать, контролировать, оценивать расхождения и определять статистически достоверно сложные параметры.
Точность по подсчету настолько высока, что ограничивается исключительно точностью пипетирования. Впрочем, этот момент достаточно просто контролировать. Так можно привести измерения к очень высокому стандарту качества.
Кроме высокой точности измерений за счет прямого подсчета мишени следует отметить и снижение эффектов ингибирования реакции за счет разбиения образца на нанокапли, детекции по конечной точке и цифровой обработки результатов.
Bio-Rad предлагает абсолютно стандартные приборы для цПЦР с полностью готовой инфраструктурой, программным обеспечением и расходными материалами, которые поставляются производителем непрерывно и продаются свободно.
Эти наборы (супермикс для количественного определения остаточной ДНК (Residual DNA) методом ddPCR (QX200)) доступны в четырех версиях: на 200 реакций (2 х 1 мл), 500 (5 х 1 мл), 2500 (5 х 5 мл) и 5000 (10 х 5 мл) реакций – их хватает в зависимости от загруженности производства на разное количество образцов объемами по 20 мкл в сутки или в неделю.
Если приводить примеры оценки чувствительности данного метода (ddPCR), можно увидеть, как при последовательном разбавлении и определении ДНК E.coli (кривая А, интервал от 5 фемтограммов до 50 пикограммов) или клеток организма высшего млекопитающего (кривая В, интервал от 0,3 фемтограмма до 3 пикограммов) не будут происходить загибы этой стандартной кривой – то есть определение концентрации ДНК показанным методом в сравнении с количеством образца, который внесен в смесь. Вплоть до 5 фемтограммов будет наблюдаться линейный отклик, что является очень хорошим результатом.
Если посмотреть на альтернативные предложения на рынке цПЦР, следует указать на возможность существования приборов Thermo FS QuantStudio 3D и станций Qiagen QIAcuity, рассчитанных на разную производительность. Действительно, эти приборы не хуже, а по некоторым параметрам даже лучше, чем продукция Bio-Rad. Но очень важно, что они предназначены все-таки для других задач, потому что наборов для анализа остаточной ДНК с помощью данных приборов нет. И если такая задача при контроле на производстве поставлена, у пользователя практически нет альтернатив, какую использовать приборную базу: только у Bio-Rad есть эти замечательные наборы, позволяющие решать задачу определения остаточной ДНК.
Эта система позволяет сделать использование метода цПЦР достаточно быстрым в сравнении с реалтайм-ПЦР. В первую очередь экономия времени достигается за счет устранения ручных операций, необходимость в которых просто отпадает: пользователь берет мастер-микс, образец, сливает по протоколу, ставит в прибор, прибор работает – пользователь получает результат.
Можно ознакомиться с видеороликом, посвященным использованию прибора.
Здесь показана возможность разбиения расходного материала для устройства – чипов-планшетов, на которых происходит реакция – на ячейки. Тогда можно сразу много экспериментов, которые проводятся параллельно – например, контроль качества с десяти участков – проводить на одном чипе, если не нужна избыточность выборки и достаточно 2000 ячеек на один образец, чтобы в них смотреть сигнал.
Отметим, что в свое время еще была создана система QX100, а также на рынке существует система AutoDG пробоподготовки и создания капель, совместимая с обеими системами (QX100 и QX200). Пользователь, у которого есть QX100, может докупить систему генерации капель и работать таким образом – наборы совместимы с обоими приборами.
Важно упомянуть, что данная система является сравнительно экономичной к реагентам благодаря эффективному программному обеспечению, которое считает, сколько нужно реагента на запуск одного планшета для амплификации. Пользователь может так собирать статистику и увеличивать эффективность расхода реактивов со временем.(Рис. 1-4)
Специализированные картриджи являются основным расходным материалом, который нужно закупать к прибору дополнительно.(Рис. 5)
Что касается совместимости с пластиком, производители не сообщают ни о каких ограничениях, и можно считать, что подойдет любой пластик, который механически совместим с держателями – здесь проблем быть не должно.
А вот масло, которое используется для генерации капель.(Рис. 6)
Стандартная раскапывающая система помогает генерировать капли из исходных образцов в специализированных картриджах, автоматически производить раскапывание и генерирование, что сильно ускоряет процесс и снижает влияние оператора.(Рис. 7-8)
На иллюстрации показано, как в микрофлюидном чипе генерируются капли – главное, что все они одинаковые, и это принципиально.(Рис. 9-11)
После автоматической генерации капель оператор берет плашку, запечатывает в устройстве для запечатывания и ставит в амплифиактор.(Рис. 12-13)
Так работает метод с точки зрения оператора.
Можно сформулировать вывод: в целом наборы для системы Bio-Rad QX200 – это самое лучшее решение для анализа остаточной ДНК в промышленных образцах, ну а на самом деле единственное решение для такого анализа по крайней мере из того, что предлагает Bio-Rad.
Это валидированные наборы под конкретную задачу, которые соответствуют всем характеристикам, обсужденным сегодня, и оптимизированы для систем Bio-Rad QX200. Устроены они по принципу супермикса, в котором за небольшое количество стадий, показанных на видео, возможна постановка амплификации, а дальше нужно просто перенести плашку, в которой прошла амплификация, в детектор и считать результат.
Валидированные супермиксы с высоким уровнем точности и чувствительности для прямого количественного определения остаточной ДНК позволяют работать без выделения ДНК, нечувствительны к ингибиторам, сами проверены на отсутствие РНКаз и ДНКаз, рас считаны на количество реакций от 200 до 5000 с объемом образца по 20 мкл и оптимизированы для системы Bio-Rad QX200.
Если возникает какой-то вопрос по принципу применения, нужно описать специфику задачи: обычно в смесях промышленных образцов много ингибиторов, поэтому нужно выделить ДНК. Но остаточная ДНК, которую мы ищем, часто теряется при выделении, поэтому есть риск получения ложноотрицательных результатов.
По поводу калибровки в реалтайм-ПЦР: для этого по приведенной схеме делается три повтора, что очень громоздко. Метод получается трудоемкий, отнимает много времени и при этом не является очень надежным, поскольку остаточная ДНК все-таки теряется.
А в цПЦР задействована такая схема, что, несмотря на наличие в смесях множества ингибиторов, достаточно сделать разведение сырого образца 1:100. Остаточная ДНК не теряется при выделении, пользователю не нужно калибровать цПЦР – она уже один раз откалибрована – и все.(Рис.14)
И это позволяет избежать ложноотрицательных результатов и не терять ценный для анализа сигнал. Таким образом, используется всего один повтор для получения достоверных воспроизводимых результатов. За счет этого метод становится легким, быстрым и надежным, что пользователю, собственно, и нужно.
Так что можно с уверенностью утверждать: наборы для системы QX200 от Bio-Rad – лучшее решение для определения остаточной ДНК.
Контакты для тех, у кого возникнут вопросы, приведены ниже: RR@dia-m.ru, тел. +7 (916) 362-65-87.
Ссылки на остальные части вебинара:
Новость о вебинаре «Биотехнология: одноразовые и классические технологии в масштабировании и производстве»
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
