Секвенирование методом Сэнгера. Часть 4. Фрагментный анализ

• Стадии фрагментного анализа
• Полимеры и их выбор

Самая распространенная область применения этого метода – микросателлитный анализ. Микросателлиты – это короткие тандемные повторы, ограниченные консервативными областями, и их исследование используется для генотипирования животных и растений, идентификации их клеточных линий, а также для исследований по определению отцовства и в целом для идентификации личности, например, в различных криминалистических лабораториях.

Также эта технология применяется в SNP генотипировании (исследовании однонуклеотидного полиморфизма) при помощи набора SNaPshot, «фингерпринтинг анализ», который сейчас, правда, не слишком популярен, также в анализе флюоресценции: это актуально преимущественно для научно-академических лабораторий и таких задач как оценка потери гетерозиготности и микросателлитная нестабильность, CNV (вариация числа копий генов) и т.д.

Рабочий процесс фрагментного анализа похож на капиллярное секвенирование, но содержит меньше шагов.

Правда, пользователи чаще начинают именно с секвенирования, потому что у него меньше требований по адаптации рабочего процесса. А потом делается следующий шаг – расширение задач лаборатории в сторону применения фрагментного анализа, в котором больше всего вопросов вызывает адаптация условий эксперимента, а также анализ данных.

Стадии фрагментного анализа

1. Экстракция ДНК;
2. ПЦР амплификация с парой праймеров, один из праймеров имеет флуоресцентную метку.
3. Подготовка образца для загрузки в прибор: продукт амплификации смешивается с формамидом и размерным стандартом – набором фрагментов ДНК известной длины, окрашенных одним типом флуоресцентного красителя. Размерный стандарт нужен, чтобы прибор мог картировать ваши искомые фрагменты ДНК в своей системе и давать корректный ответ.

ВНИМАНИЕ: Даже использование размерного стандарта известной длины не позволяет рассчитать результаты, получаемые на секвенаторе какой бы то ни было марки так, чтобы считать их абсолютной цифрой. Если получен пик длиной 500 пар оснований, это не значит, что там реально содержится 500 пар оснований. В результатах значима разница между пиками: если получены пики в 500 и 700 пар оснований, эта разница имеет значение, она реальна, абсолютный размер фрагментов – нет. Зачастую исследователи пытаются использовать абсолютную цифру, но это не совсем корректно: такое значение может меняться в зависимости от многих параметров.

Чтобы получить абсолютную цифру, например, в криминалистике, используются еще помимо размерного стандарта аллельный лэддер – реактив с точками-маяками известной длины. Но этот реактив создан только для работы с человеческой ДНК, а для животных и других объектов вариантов нет.

4. Запускается секвенатор для разделения фрагментов.
5. Анализ результатов с использованием специализированного программного обеспечения:

Gene Mapper – программа с большим диапазоном различных вариаций и возможностей,

Peak Scanner – компактная версия, которую можно найти в облаке, беднее по функционалу, но тоже рабочая.

ВНИМАНИЕ:

• Для работы с фрагментным анализом один из праймеров должен быть флуоресцентно меченым.
• Прибор нужно калибровать под те красители, с которыми вы планируете работать: которыми будете метить ваши фрагменты, и которые присутствуют в размерном стандарте, планируемом к использованию.

Размерные стандарты из предоставляемого их множества подбираются под конкретные задачи. Формат названия размерного стандарта: «LIZ 600», где LIZ – значение красителя, 600 – длина самого длинного фрагмента в этом пуле известных фрагментов.

Для грамотного построения эксперимента нужно выбирать размерный стандарт так, чтобы искомые фрагменты были всегда короче двух последних фрагментов размерного стандарта и длиннее двух первых фрагментов. Тогда на форезе сначала выйдут два фрагмента размерного стандарта, потом ваши фрагменты, потом еще два фрагмента размерного стандарта. Это идеальная картина – в реальности ситуация иногда бывает иной.

Процесс проводится в формамиде.

Полимеры и их выбор

Для работы с каждой задачей нужно использовать подходящий тип полимера. Нужно изучить инструкцию к своему прибору, выяснить, какие есть модули, комбинации для запуска прибора, и если вы не работаете с идентификацией личности и отцовством, то стоит остановиться на POP6 или POP7 как самой универсальной версии полимера.

Важно оценивать, что вы собираетесь делать на своем секвенатора. Если вы будете выполнять и секвенирование, и фрагментный анализ, лучше всего выбрать один тип полимера и один тип капилляров для всех задач. Нужно выбрать один полимер и проверить настройки запусков, доступные в вашем секвенаторе – RUN модули. Нужно, чтобы тип выбранных полимера и тип капилляров соотносились и для секвенирования, и для фрагментного анализа. Требуется чтобы такие модули присутствовали при переходе от одного приложения к другому.