Секвенирование методом Сэнгера. Часть 3. Реактивы, материалы и программное обеспечение

• Полимеры для капиллярного секвенирования
• Наборы реактивов для капиллярного секвенирования
• Программное обеспечение для капиллярного секвенирования

На текущий момент ThermoFisher Scientific предлагает несколько типов полимеров для работы на приборах и несколько типов химии для проведения реакции секвенирования.

Разные типы реактивов рекомендованы для определенных типов полимеров, каждый из которых отличается от других вязкостью, и каждый набор реактивов обладает своими особенностями.

Сейчас наиболее популярными типами химии для секвенирования можно считать BigDye Terminator V 3.1, а также Big Dye Terminator V 1.1. Совершенно не популярен BigDye Terminator Direct.

Полимеры для капиллярного секвенирования

ThermoFisher представляет полимеры четырех типов, в частности, POP7 и POP6, а также POP4, который в большей степени используется в криминалистике.

Еще один полимер POP1 специально разработан для секвенаторов SeqStudio и только для них.

Наборы реактивов для капиллярного секвенирования

Набор BigDye Terminator V 3.1 позволяет читать максимально длинные фрагменты ДНК: в некоторых случаях возможно чтение до 1000 пар оснований (но в редких случаях). Однако он дает не очень хорошее чтение близко к праймеру: старт будет не самым хорошим. Тем не менее эта химия сейчас наиболее популярна. Ее оптимально использовать с полимером POP7. Это не значит, что с POP6 она работать не будет, но POP7 – это для нее идеальная пара.

BigDyeTerminator V 1.1 дает более короткие прочтения – порядка 400…600 или 650 пар оснований, но с очень хорошим чтением уже от праймера. Эту химию идеально комбинировать с полимером POP6.

BigDye Direct объединяет в себе преимущества двух выше перечисленных химий: очень хорошо читает от праймера фрагменты до 700…800 оснований. Непопулярность ее вызвана необходимостью подготовки праймеров для использования с ней: обычные праймеры не подойдут, к ним нужны адаптеры.

Кроме того, два первых типа реактивов можно использовать с существенным разбавлением, а BigDye Direct разбавить нельзя, так что его использование получается менее выгодным.

Следует отметить новый набор Sanger Sequencing Kit, объединяющий в себе три основных компонента: BigDye Terminator V. 3.1, ExoSap-IT Express для очистки перед секвенированием и BigDye Xterminator для очистки продуктов реакции секвенирования.

Набор идеален для тех, кто работает с небольшим количеством образцов, а также для использующих самый компактный прибор от ThermoFisher – SeqStudio, который не требует консервации, но используется время от времени. Для небольших лабораторий этот набор оптимален: в нем есть всё для проведения реакции секвенирования.

Набор рассчитан на 200 реакций, но эти 200 реакций описаны уже с условием разбавления химии для секвенирования BigDye Terminator. Это значит, что ровно на 200 реакций хватит ExoSap-IT Express, на 200 реакций – BigDye Xterminator, но будет присутствовать (если переводить на аналог отдельных компонентов) одна пробирка BigDye Terminator на 100 реакций. При разбавлении его по инструкции получается, что его хватит на 200 реакций.

Программное обеспечение для капиллярного секвенирования

Анализ данных в капиллярном секвенировании имеет не меньшее значение, чем подготовка образцов и собственно процесс секвенирования, поэтому его нужно выполнять максимально грамотно.

ThermoFisher Scientific создает условия для максимально комфортного анализа данных пользователями своей продукции и поэтому предлагает все типы программ, которые могут понадобиться.

Программное обеспечение, доступное на компьютере

• Sequencing Analysis Software – программа для базового анализа данных секвенирования: просмотра полученных данных, «подрезки всех концов», оценки «сырых» данных. Некоторые виды стороннего программного обеспечения предоставляет пользователю только обработанные данные – например, ровные пики, но в секвенировании для поиска каких-либо проблем важно видеть именно сырые данные, силу сигнала и пр.
• SeqScape Software и Variant Reporter Software позволяют работать с базами данных и поиском вариантов для расшифровки полученных данных.
• Sequence Scanner Software - ,олее простая версия программного обеспечения – .
• MicrobeBridge Software позволяет работать с микробиологическими образцами и сравнивать их с базой данных MicrobeNet.
• Minor Variant Finder Software позволяет работать с минорными аллелями, если представленность минорного аллеля в образце составляет порядка 5%. Это можно использовать для онкологических образцов и ряда других биологических исследований.

Бесплатные программы в облаке на сайте ThermoFisher Scientific

• Applied Biosystems Analysis Module Quality Control Software – аналог Sequencing Analysis, но попроще; в этом приложении также можно увидеть сырые данные, подрезать образцы, осуществить обработку результатов. Удобно использовать эту программу тем, кто не является владельцем секвенатора и отдает образцы на аутсорсинг, но хочет ознакомиться с сырыми данными. В таком случае он может зайти на облако и сделать это, воспользовавшись данной программой для оценки своих образцов.
• Applied Biosystems Analysis Module Variant Analysis Software позволяет выравнивать образцы на референсы и искать варианты, похожа по функционалу на Variant Reporter.
• Applied Biosystems Analysis Module Next-generation Confirmation Software доступна только в облаке. Она объединяет данные секвенирования по Сэнгеру и высокопроизводительного секвенирования. – в первую очередь на секвенаторах ThermoFisher. Это программное обеспечение позволяет проводить валидацию данных одного метода данными другого без конвертации формата данных (файлы имеют расширение *.vcf).