Секвенирование методом Сэнгера. Часть 2. Оборудование. Очистка продуктов

• Последовательность рабочего процесса
• Для чистоты эксперимента
• Альтернативные методы очистки
• Особенности BigDye Xterminator

Поговорим о том, какие расходные материалы используются в капиллярном секвенировании и чем можно дополнить рабочий процесс в лаборатории, чтобы работать стало комфортнее.

Последовательность рабочего процесса

1. Экстракция ДНК;
2. ПЦР амплификация;
3. Очистка продуктов ПЦР – этот шаг достаточно часто опускают, не придавая ему должного внимания, хотя он влияет на качество получаемого результата;
4. Собственно реакция секвенирования;
5. Очистка продуктов реакции секвенирования;
6. Капиллярный электрофорез на приборе с использованием всех необходимых расходных материалов;
7. Анализ данных.

Для осуществления процесса понадобится следующее оборудование.

• Капиллярный секвенатор с программным обеспечением, на котором идет разделение фрагментов,
• Обычные амплификаторы, которые понадобятся для реакций амплификации и последующего секвенирования,
• Рекомендуется обзавестись флуориметром (например, Qubit) – он позволит точно оценить количество ДНК, чтобы максимально грамотно подготовить реакционную смесь для реакции секвенирования, внести нужное количество реактивов, чтобы получить максимально длинный и хорошего качества фрагмент для секвенирования;
• Не следует пренебрегать и аппаратом для обычного гель-электрофореза, поскольку эта технология позволит увидеть, насколько качественно сработали праймеры, нет ли второго продукта, который вам не нужен. Флуориметр не сможет отсеять второй продукт. Если их два, то гель-электрофорезом можно выделить оба.

У ThermoFisher Scientific есть полный набор решений в нескольких разных вариантах, «закрывающий» любые потребности.

Для чистоты эксперимента

Следует обратить внимание на две стадии и два продукта.

• Очистка продуктов ПЦР, часто игнорируемая, хотя ее степень влияет на качество получаемого результата
• Очистка продуктов реакции секвенирования.

В числе новых решений от ThermoFisher Scientific следует назвать два – оба существенно улучшают качество получаемого сиквенса (последовательности) на выходе, а зачастую позволяют получить результаты, которых без их использования не достичь.

• ExoSAP-IT/Express – набор для ферментативной очистки продуктов ПЦР.

Он использует экзонуклеазу и щелочную фосфатазу: некоторые сотрудники лабораторий пользуются такими методами очистки, изготавливая подобные смеси самостоятельно. Но принципиальное удобство и преимущество этого набора из линейки ThermoFisher Scientific в том, что он используется в самом коротком протоколе очистки продуктов реакции секвенирования и ряда продуктов для фрагментного анализа.

Протокол занимает всего пять минут и не требует многократных переливаний образца из пробирки в пробирку. Так исключается вероятность контаминации, ошибок в виде потери материала: реактив просто добавляется в пробирку и инкубируется при двух разных температурах, а спустя пять минут на выходе вы получаете очищенный продукт.

Такое решение полностью валидировано для работы с BigDye терминаторами – химией для секвенирования, а также для работы с протоколом SNaPshot –технологии, разработанной для фрагментного анализа, которая занимает промежуточную позицию между секвенированием и фрагментным анализом.

В инструкциях от ThermoFisher можно найти больше рекомендаций о том, как строить рабочий процесс с реактивами, предоставляемыми компанией. Если возникают какие-то трудности, то пользователь всех реактивов ThermoFisher Scientific может обратиться к службе поддержки, и у последней больше шансов помочь пользователю и разобраться, когда реактивы используются комплексно. Кроме того, при необходимости можно приобрести у одного поставщика всё, что требуется для рабочего процесса (это как минимум удобно).

Ферментативно очищается ОДИН продукт реакции. Если их больше, пользователя это не устроит. Но для простого рутинного процесса такой метод очистки удобен и позволяет не тратить много времени.

Альтернативные методы очистки

Альтернативные методы очистки подразумевают использование магнитных частиц или колоночного метода. У обоих есть свои преимущества, но времени тот и другой потребуют больше.

Магнитные частицы выгодно использовать, если есть робот для работы с такими наборами, иначе метод не слишком удобен.

То же самое с колонками: не всегда это удобно, нужно помнить о насыщении колонок, из которых не всегда удается выделить весь доступный материал, а ведь его может быть не так много.

ThermoFisher Scientific предлагает несколько продуктов, различающихся по цене и затратам времени на очистку. ExoSAP-IT/Express не слишком дорог, хорошо хранится, дает результат и облегчает рабочий процесс.

BigDye Xterminator Purification Kit – специальный набор для удаления несвязанных терминаторов и солей после проведения реакции секвенирования.

Очистка продуктов реакции секвенирования необходима, чтобы в капилляры не попали продукты, также имеющие флуоресцентную метку: они тоже могут двигаться в капилляре, давать излишнюю засветку и не позволять увидеть основной сигнал (собственно сиквенс).

В состав набора входят две бутылочки: в одной находятся микросферы с очень маленькими отверстиями, в другой – раствор. Со взвесью микросфер в растворе-буфере и нужно будет работать: это субстанция для очистки полученных продуктов секвенирования.

Из существенных плюсов протокола с использованием этого набора можно назвать простоту и сжатость во времени: он включает всего несколько шагов. Такой набор валидирован для работы с различными решениями ThermoFisher, химией и рабочим процессом для SNaPshot Опять-таки можно заказать полное решение от ThermoFisher.

Для сравнения: в обычных лабораториях как наиболее бюджетный вариант используют этанол для очистки продуктов реакции секвенирования, которые потом отправляют на сиквенс. При этом можно столкнуться со следующим явлением.

На картинке слева каждая из вертикальных дорожек – это капилляр, а маленькие полосочки в капилляре – это фрагменты, которые разделялись в капилляре по размерам и двигались группами. Флуоресценция этих групп фрагментов считывалась. Там, где видны большие пятна – голубые или зеленые с желтой окантовкой – это засветка от очень большого количества различных флуоресцентно меченных продуктов, которые пошли в капилляр, не будучи удаленными заранее. Это может быть несвязанный терминатор или, например, димеры праймеров.

Если же посмотреть на обработанный сиквенс, то получится вот что: сверху сначала идет сиквенс не очень хорошего качества, по мере удаления от старта ситуация улучшается, а потом мы наблюдаем выброс – аномально высокие пики, мешающие прочтению сиквенса. В таком случае приходится либо смещать праймер, располагая его по-другому, чтобы этот участок читался, либо вовсе переделывать эксперимент.

Особенности BigDye Xterminator

С BigDye Xterminator мы не избавлены от таких ситуаций полностью, но качество сиквенса в любом случае получается более чем удовлетворительное – все пики прочитываются.

Следует помнить о важном моменте при использовании этого набора.

Нужен специальный вортекс с высокой скоростью, чтобы можно было эффективно смешать микросферы с буфером и продуктами реакции. В инструкции от ThermoFisher Scientific приведены основные рекомендованные модели вортексов.

Чтобы минимизировать перенос и ручной труд, желательно иметь еще и плашечную центрифугу. Этого нет в руководствах пользователя, но по отзывам самих пользователей известно, что подходят самые бюджетные от Biosan, чтобы трясти плашку со смесью и центрифугировать.

Если вернуться к прописанному в инструкции ThermoFisher, есть возможность максимально увеличить пропускную способность при его использовании: ряд шейкеров позволяют работать с 96- и 384-луночными плашками и использовать до 18 плашек единовременно, что может быть интересно для высокопоточных лабораторий.

Рабочий процесс занимает 30 минут и состоит из следующих стадий.

1. В плашку с продуктом реакции секвенирования добавляется раствор, состоящий из микросфер с микроотверстиями и буфером. Эту взвесь необходимо с максимальной интенсивностью потрясти на вортексе.
2. В микросферы попадают все мелкие ненужные продукты, которые могут давать флуоресценцию,
3. Далее эту взвесь подвергают центрифугированию: если у пользователя есть плашечная центрифуга, ничего не нужно никуда переносить, в плашку добавляется смесь, ее встряхивают на вортексе, центрифугируют и далее ту же самую плашку можно ставить в секвенатор.
4. Выбрав соответствующий режим работы секвенатора – режим для образцов, очищенных с помощью BigDye – пользователь запускает процесс. В капилляры будет производиться забор надосадочной жидкости из образца и будет секвенироваться содержимое. Таким образом ни одного переноса продукта в какие-либо другие плашки или пробирки не осуществляется.
5. В отсутствие плашечной центрифуги нужно выполнять ряд процедур в пробирках, а потом при необходимости из пробирок отобрать надосадочную жидкость, перенести в чистую плашку и поставить секвенироваться в обычном режиме.

Из альтернативных методов, которые используются на текущий момент для очистки, следует отметить спирт (это самый часто встречающийся метод, что обусловлено его дешевизной и доступностью). Второй вариант – это колонки.

С использованием спирта или колонок рабочий процесс становится гораздо длительнее, его сопровождает большее количество переносов, что может вызвать ошибку, понадобится большее количество пластика, который тоже стоит денег. В случае этанола нужно очень тщательно следить еще и за его концентрацией, потому что даже небольшие изменения в концентрации этанола в результате его долгого хранения могут вызывать отклонения в качестве очистки.