История
История
Вестерн-блоттинг – высокочувствительный метод определения в смесях (образцах) специфичных белков при помощи антител. Суть метода в первоначальном разделении белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим переносом на мембрану, на которой их детектируют с помощью специфичных к конкретному белку антител.
Для всех стадий этого процесса ThermoFisher Scientific предлагает свои аппаратные решения.
Так, для первоначальной обработки проб с целью выделения белков у ThermoFS есть несколько разных наборов, в частности доступно выделение на магнитных частицах и автоматизация этого процесса через прибор Kingfisher Apex.
Далее смесь, содержащую белки, необходимо «разогнать» с помощью электрофореза на геле. Подготовку такого геля проводят двумя путями: на рынке доступны готовые предварительно залитые гели, к которым нужно добавить соответствующие маркеры, пробы – и можно начинать гель-электрофорез. Но заливку геля можно выполнить самостоятельно.
ThermoFS предлагает систему для заливки гелей под названием SureCast Gel Handcast Station.
Ее преимущество в едином спейсере, в чем можно убедиться, если достать сами стекла. Благодаря этому в эксперименте полностью исключены протечки. Есть щель для контакта геля с буфером: когда пользователь вставляет стекла с гелем внутрь столика, эта щель надежно перекрыта «подушечкой», которая находится сзади нее, и поэтому протечки просто не может быть. После того, как система закрыта, ее можно поставить под углом 45 градусов, после чего она сохраняет устойчивость, и заполнять сначала разделяющим гелем до линии, а потом наслоить концентрический гель, вставить гребенку с определенным количеством кармашков и дождаться полимеризации. Гель при заливке идет самотеком, наслаивается и не проливается, что очень удобно. Кроме того, стекла достаточно толстые, и не нужно сливать агарозную пробку: есть отверстие, через которое гель сам «производит» пробку, потому что отверстие прижимается к специальным резиночкам.
Потом устройство следует открыть, достать гель и перенести в камеру. Этот процесс занимает время, требует определенных навыков и подготовки, но его можно реализовать самостоятельно.
Но можно пойти по более легкому пути и воспользоваться готовым гелем – например, 10%-ным Bis-Tris.
ThermoFS предлагает гели под различные процессы – их можно подобрать на сайте. Например, есть очень интересные гели с коническими лунками – чтобы проба вся туда стекала, а также с лунками deep-well, в которые входят 60 мкл пробы. Каждый гель поставляется в индивидуальной упаковке, с небольшим количеством буфера, предотвращающим пересыхание геля. Упаковку нужно вскрыть, стряхнуть лишний буфер, удалить гребенку, а также удалить полоску, которой заклеена щель для контакта геля с буфером – если этого не сделать, гель-электрофорез не пойдет. Затем пластину с гелем вставляют внутрь камеры и поджимают.
Система готова к нанесению образца. Его добавляют в соответствующие лунки и запускают гель-электрофорез. Устанавливаем напряжение 200 вольт. Этот параметр и использование буфера MES SDS сокращает время фореза: полное разделение произойдет за 20 минут.
Буферы Novex – часть портфолио ThermoFS для проведения электрофореза.
На сайте компании есть информация о многочисленных продуктах с возможностью их подбора. Доступна информация по выбору гелей, буферов и других компонентов и на флеш-носителях. Условия эксперимента пользователь подбирает в зависимости от белков, которыми он располагает, индивидуально. Буферы, белки, мембраны, концентрация геля могут быть разными, и к ним у ThermoFS есть таблица рекомендаций по подбору компонентов.
Отметим, что на пластике нанесены картинки самих лунок – это позволяет практически вслепую работать дозатором и не промахнуться при заполнении камеры буфера, поскольку при этом не видно границы полиакриламидного геля.
После добавления образца на систему надевается крышка и ее подключают к источнику тока: плюс к плюсу, минус к минусу, а затем выбирают нужный протокол – он занесен для каждого геля.
Вообще для электрофореза есть несколько видов камер. Маленькая рассчитана на один гель, в нее входит всего 40 мл буфера.
Есть побольше – у нее отсеки находятся бок о бок, есть белая подложка, позволяющая пользователю видеть, как наносятся пробы, как разгоняются эти пробы и маркёр. Два отсека разделены перемычкой и не связаны. Можно проводить электрофорез только в одном отсеке, тогда буфера нужно взять вдвое меньше. Отсеки находятся бок о бок: пользователю не нужно потом камеру переворачивать, а у некоторых производителей отсеки находятся один за другим, это вынуждает переворачивать камеру. Но чем меньше манипуляций и движений производится с камерой, тем лучше идет форез.
Электроды находятся далеко друг от друга, и это позволяет не ставить камеру в лед или охлаждать иным способом: весь процесс проводится на рабочем столе.
По окончании электрофореза нужно перенести разделенные белки на мембрану. Подход к этому процессу зависит от размеров белков: если они достаточно крупные (больше 250-300 килодальтон), рекомендуется проводить перенос мокрым способом. Для этого ThermoFS предлагает специальный модуль (вставку в камеру) – с его помощью пользователь собирает своеобразный «сэндвич» и проводит перенос в той же камере – так что она получается многофункциональная, и эта гибкость в работе очень удобна.
Для более мелких белков рекомендуется оборудование Power Blotter – этот прибор за 7 минут полусухим способом проведет перенос. Этот прибор представляет собой две пластины – катод и анод, плюс и минус. Между этими пластинами кладется «сэндвич», собираемый так.
Берется готовый стак для процесса: он поступает в упаковке, его нужно распаковать и верхнюю часть отложить, а нижнюю переложить в «блотницу».Затем следует достать кассету с гелем. Если кассета использовалась предзалитая и заранее готовая, она пластиковая и ее нужно вскрыть – шпателем, аккуратными движениями, чтобы добраться до геля и переложить его на мембрану. Параллельно убирают ненужные компоненты, например, гребенку и самое дно геля. После этого аккуратными движениями, чтобы не порвать гель, перекладывают этот гелевый слой на мембрану.
С помощью ролика гель нужно аккуратно раскатать, чтобы избавиться от пузырей: белки «умеют» переходить с геля на мембрану, но не переходят сквозь слой воздуха. Потом нужно взять верхнюю часть стака и накрыть гель сверху – получится так называемый сэндвич вестерн-блота. Его еще раз нужно прокатать роликом – в идеале нужно избавиться от всех пузырей.
Далее систему нужно закрыть. Крышка подпружинена, поэтому, если стаки немного отличаются по толщине или пользователь работает не на готовых стаках, а собирает их сам, то пружинящая крышка это нивелирует.
При использовании готовых стаков можно выбрать предзапрограммированные режимы. Например, для одного блота выбираем средний: 7 минут, 25 вольт на 1,3 ампера. Нажимаем кнопку «Старт» – процесс начался, пошел обратный отсчет времени, можно с уверенностью ожидать результата через 7 минут.
В дополнение к малой длительности исключается «разбегание» белков в растворе: перенос получается очень качественно. На тяжелые белки в этом случае потребовалось бы больше времени, поэтому для них мокрый перенос в камере предпочтительнее.
Технология сухого переноса практически такая же, за небольшими исключениями. Для нее ThermoFS предлагает прибор iBlot 2 Dry Blotting System. Он отличается от PowerBlotter тем, что сюда вставляется специальный стак уже с мембраной, электродами и буфером – он одноразовый. Обычно это оборудование используется в каких-то автоматизированных процессах, где нужна очень хорошая воспроизводимость – например, в фармакологических компаниях, которые часто используют именно iBlot.
Итак, пользователь вставляет гель с белками в одноразовый стак, закрывает, выбирает нужный протокол. В зависимости от выбранного протокола длительность переноса составляет от 5 до 10 минут.
По завершении переноса нужно визуализировать то, что содержится на мембране – для этого в основном используются антитела, с которыми и нужно загибридизовать белки на мембране – и показать, что в смеси присутствуют интересующие пользователя белки. Для гибридизации ThermoFS разработала устройство под названием iBind. Оно работает без электричества. В работе используются специальные кассеты, которые вставляются в прибор.
Без этого прибора пользователь готовит раствор первичных антител, после чего инкубирует мембрану с этим раствором на ночь, на следующее утро отмывает мембрану, потом обрабатывает раствором вторичных антител – на это уходит порядка 2 часов, далее следует отмывка от вторичных антител – на все эти процессы уходит ночь и полдня.
В iBind нужно взять кассету-карточку, положить ее в прибор и закрыть крышку. В течение всего эксперимента прибор просто лежит на столе. Раствор первичных антител наносится в первую лунку прибора в объеме 2 мл.
Во вторую лунку наносится специальный отмывочный буфер – 2 мл. В третью лунку наносятся вторичные антитела – 2 мл. В последнюю, самую большую лунку помещается отмывочный буфер объемом около 8 мл. В итоге расход антител существенно снижается (2 мл + 2 мл), чем если бы окрашивание мембраны проводилось в чашке Петри или ванночке и качать на качалке такую систему тоже не нужно, как и инкубирований на ночь. Окраска обоими антителами пройдет за 2-2,5 часа.
Как это происходит? С помощью латерального движения жидкости с учетом капиллярных эффектов фронтом идут сначала первичные антитела, затем – уникальный буфер, который позволяет не забивать мембрану БСА и отмывать не связавшиеся антитела. Потом тоже фронтом идут вторичные антитела, а в конце отмывочный буфер.
Такие устройства сравнительно недороги, и их можно купить в лабораторию сразу несколько.
Кроме того, ThermoFS предлагает систему iBind Flex, работающую по такому же принципу, но позволяющую использовать миди-мембраны или мембраны, разрезанные на стрипы. Тогда можно за один эксперимент нанести до 6 вторичных антител, смотреть, как «срабатывают» пары антител, подбирать лучшие сочетания и антител, и их концентраций. Те, кто работал с анализом белков, знают, что иногда антитела между собой как-то конкурируют и в итоге не получается хорошей красивой картинки только поэтому
В эксперименте, демонстрируемом на мастер-классах, в качестве мембраны берется фильтровальная бумага, а вместо антител берут пищевые красители, чтобы визуализировать сущность процесса: это позволяет за 15 минут показать процесс, который в реальном эксперименте с настоящей мембраной, белками и антителами занимает 2-2,5 часа (но можно оставить процесс и на ночь, это не испортит результат). После этого мембрану можно достать, немного промыть дистиллированной водой.
Следует упомянуть интересный реагент – это No-Stain Protein Labeling Reagent.
Этот чувствительный реагент позволяет окрасить тотальный белок на геле или мембране, связываясь с лизиновыми остатками как на гелях, так и на мембранах. Так можно нормализовать и визуализировать на любом процессе проводимый вестерн-блоттинг, исследуемую пробу.
ThermoFS также предлагает ряд решений для иммуноферментного анализа.
Если подсчитать, сколько отмывок необходимо для классического ИФА, даже если учесть минимальные потребности метода (а в некоторых протоколах ИФА говорится, что каждый шаг нужно 3-4 раза повторить и отмыть – например, связать первичные антитела, потом отмыть, далее вторичные – и отмыть и пр.) – получается немалое количество.
ThermoFS предлагает решение – большой выбор первичных и вторичных антител, оборудование и пластик для ИФА, а также Precoated Plate с уже имеющимися в лунках дисками. Есть еще стрипы: можно отобрать необходимое их количество по числу проб, которыми располагает пользователь, отмывок получается уже в 2-3 раза меньше. На этих Precoated Plate уже на подложке связаны первичные антитела, потому процесс происходит быстрее, требуется меньше отмывок.
Есть еще наборы Instant, подбираемые индивидуально для какие-либо конкретных анализов – при их использовании требуется одна отмывка. Пользователь добавляет образец, потом блотирует и визуализирует уже в приборе. Туда входят уже готовые стандарты – это очень удобно.
Плашки с наборами изготовлены в форме стрипов, если у вас менее 96 образцов, можете просто убрать эти стрипы и использовать их в дальнейшем.
Для ИФА наборов нет медицинского регистрационного удостоверения, пока эта продукция может использоваться только под научные задачи.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
