История
История
При работе с клетками необходимо выделить целевую популяцию из смеси клеток.
ThermoFS предлагает для этого систему ROTEA – разработку под брендом GibCo, существующим более 60 лет. Эта система – воплощение столь огромного опыта.
Она может использоваться в исследованиях и различных клинических приложениях и подразумевает работу с разными объемами клеток. ROTEA поставляется с одноразовыми китами (комплектами), на которых присутствуют своеобразные «провода» – стерильные запаянные трубочки.
Пользователь срезает их непосредственно перед использованием и присоединяет необходимый источник: мешок с кровью, бутылка с каким-либо реактивом – то, с чем производится работа и что используется в качестве исходного материала. Далее смесь поступает по системе «проводов» в воронку, в которой создается очень сильное раскручивание образца. За счет этого происходит сепарация на две зоны – при наблюдении за процессом видно, что даже по цвету такие фракции различимы.
Так можно разделять клетки по их размеру и весу. В зависимости от характера объекта целью такого процесса может быть избавление от мертвых клеток, разделение мононуклеаров и др. Также с помощью этой системы можно концентрировать образцы и повторно разводить их в других препаратах.
Новый кит (комплект) вставляется в систему ROTEA, по системе трубочек внутрь закачивается образец с клетками и затем происходит такое разделение. Система снабжена специальным приспособлением, позволяющим избавляться от пузырей. Также в ней есть датчики – соответственно, если попадается пузырь или образец закончился, то весь процесс автоматически останавливается.
На приводимом здесь примере представлено три мешка, а может быть и больше – по количеству «проводов». Запрограммировать систему можно так, чтобы в один отсек сливался ненужный мусор либо какая-то фракция, не представляющая интереса, а в другой мешок уже сливалась целевая фракция, которую впоследствии можно сконцентрировать или непосредственно направить на модификацию – например, электропорации. Можно использовать систему и для отмывок, но в целом система предназначена для центрифугирования с целью разделения клеток по их размеру и массе.
После культивации и выделения клеток в лабораторных условиях очень часто стоит задача модифицировать их геном.
Для этого в определенные локусы генома клетки с помощью нуклеаз, в частности нуклеазы, например, Cas9, вносят двухцепочечные разрывы, а затем в этот разрыв можно вставить или нуклеотид, или целый фрагмент ДНК. Такой процесс называется редактированием генома методом CRISPR-Cas9.
В этом процессе очень важна точность: необходимо, чтобы разрывы и вставки появлялись строго в заданном месте – и больше нигде. Собственно, точность и является одним из ограничивающих факторов на сегодня, которые ограничивают развитие методов и клеточной и генной терапии.
Для решения этих задач ThermoFS предлагает свою разработку – нуклеазу Cas9 (мы ее изобразили в виде такой игрушки). TrueCut HiFi Cas9 Protein – это новая разработка – нуклеаза Cas9 повышенной точности.
Эта нуклеаза минимизирует нецелевое разрезание, но при этом сохраняет высокую эффективность редактирования в целевых локусах. TrueCut HiFi Cas9 Protein обладает гораздо более высокой точностью, чем Cas9 дикого типа и чем другие коммерчески доступные белки. Данные разработчиков показывают, что TrueCut HiFi Cas9 Protein почти полностью устраняет нецелевое разрезание в геноме клеток и работает со всеми типами клеток включая первичные, половые и иммунные – то есть клетки, с которыми наиболее тяжело работать.
Эти свойства делают такой белок хорошим кандидатом для работы именно в области генной терапии. Сейчас он пока доступен только с маркировкой «Research Use Only» – только для исследований, но компания сейчас работает над выведением на рынок белка с маркировкой «Cell Therapy Systems», то есть уже для использования при работах по клеточной терапии.
Модификация клеток начинается с подбор всех компонентов. Непосредственно внесение внутрь клетки всех этих компонентов – это трансфекция.
ThermoFS представляет для этих целей систему трансфекции Neon Transfection System, заслуживающую отдельного внимания. У нее есть ряд интересных конструктивных особенностей, которые позволяют этой системе достигать высокой эффективности трансфекции, но при этом сохранять клетки живыми, то есть гарантировать низкую токсичность процесса.
Тем, кто знаком с системами трансфекции других производителей, известно, что системы в основном работают с традиционными кюветами для электропорации, где расположены две большие пластины электродов, а между ними создана узкая щель, куда помещают клетки. Между этими электродами проходит электрический ток. При таком строении кюветы для электропорации возле этих электродов накапливаются свободные радикалы и происходят процессы, крайне токсичные для клеток. Это сводит на нет все усилия по электропорации.
Система Neon работает по-другому. Кюветой для электропорации здесь служит наконечник специальной пипетки. Внутри ее кончика «ходит» электрод, покрытый специальным сплавом золота. Такое строение «кюветы» минимизирует токсичность процесса для клеток.
Рабочий процесс происходит так: клетки из среды набираются в пипетку, больше никуда их переносить не нужно – они в пипетке помещаются в DOC-станцию, где установлена колбочка со специальным буфером. Затем на экране выбирается необходимый протокол для трансфекции, нажимается кнопка «старт», и после окончания протокола клетки опять же сразу переносятся в питательную среду для роста. Благодаря такой организации процесса без дополнительных шагов по переносу в кювету и забора обратно из кюветы создаются более мягкие условия для клеток.
Особенно это важно при работе с такими трудно трансфицируемыми клетками как первичные, стволовые или клетки крови. NEON, как показывают подтвержденные данные, дает хорошие результаты при модификации таких клеток.
С помощью этой системы можно трансфицировать даже те клетки, которые не поддаются трансфекции другими способами.
Подсчет клеток – это рутинная ежедневная процедура в любой клеточной лаборатории, очень часто ее делают вручную, в камере Горяева, в микроскопе считают клетки. Но такой процесс отнимает время, силы, и что немаловажно – он достаточно субъективен, зависит от конкретного человека, его зрения и внимания.
ThermoFS предлагает для этой задачи автоматизированное решение – счетчики клеток, такие как Countess 3. В него вставляется одноразовый и многоразовый слайд, на который нанесены клетки. По протоколу 10 мкл клеток смешивают с 10 мкл трипанового синего и наносят на слайд.
Все, что необходимо для подсчета – это вставить слайд в слот, и прибор начинает подсчет клеток. На экране будет отображено общее количество клеток и распределение их по степени жизнеспособности – количество живых и мертвых клеток. Пользователь видит изображение слайда и может визуально контролировать, что и как прибор для него считает и даже визуализирует: живые клетки обводит зеленым, мертвые – красным.
Прибор определяет не только единичные клетки, но и их конгломераты – структуры, где несколько клеток слиплись. Их он разделяет и также включает в подсчет. Такое слипание клеток с применением этого прибора не исказит данные, получаемые пользователем: за функцию разделения и определения конгломератов клеток «отвечает» специальный алгоритм программного обеспечения.
В приборе есть функция гейтирования: ему можно задавать размер клетки, ее яркость и кривизну. На основании этих параметров – например, размера клетки – можно включать в подсчет или исключать из подсчета определенные элементы, присутствующие в изучаемом образце.
Счетчик можно укомплектовать флюоресцентными кубами – источником света с фильтрами, и можно считать клетки, окрашенные флюоресцентными красителями. Это делается, например, для оценки жизнеспособности или для оценки эффективности трансфекции.
Система Neon работает по-другому. Кюветой для электропорации здесь служит наконечник специальной пипетки. Внутри ее кончика «ходит» электрод, покрытый специальным сплавом золота. Такое строение «кюветы» минимизирует токсичность процесса для клеток.
После того, как проделаны все процедуры в лаборатории, трансфицированные клетки посчитаны, оценена эффективность трансфекции, ни в одной клеточной лаборатории не обойтись без инвертированного и желательно флюоресцентного микроскопа, чтобы оценить и визуализировать все структуры клетки. Нужно видеть, как распределился там краситель, флюорофоры, оценить конфлюентность – уровень засева на чашке Петри.
Для этого ThermoFS предлагает использовать системы визуализации – например, такие, как «рабочая лошадка» Evos M5000.
От обычных микроскопов их отличает эргономичность – такая система занимает всего 45 см рабочего стола. В нее уже входит компьютер и очень дружественное для пользователя программное обеспечение. Оно обрабатывает все данные по изображению и работе с ним, по каналам флюоресценции, по объективу, какого класса объектив, каковы числовая апертура и рабочее расстояние, имеется ли фазовый контраст.
У этой системы визуализации два канала моторизации. Маркетологи и эксперты ThermoFS разработали системы визуализации именно для клеточных биологов – с той целью, что востребована рынком больше всего. А поэтому использовали статистические данные о том, какими методами микроскопии больше всего пользуются клеточные биологи.
В приборе 4 канала флюоресценции, проходящий свет, обязательно фазовый контраст и флюоресценция. Автофокус позволяет с помощью моторизованного фокуса не тратить время на работу с грубым и тонким винтами: нужно просто нажать кнопку – и происходит автофокусировка.
Моторизовано здесь и переключение между каналами флюоресценции: нужно нажать кнопку, после чего происходит передвижение флюоресцентных кубиков на соответствующие каналы. Это очень сильно экономит время.
Программное обеспечение в системах визуализации настолько легко в обращении, что эту систему продают без каких-либо дополнительных тренингов: в приборе есть «смарт-старт», при котором пользователь за 15 минут просматривает основные моменты о применении прибора и софта, после чего может приступать к своему первому эксперименту. Это очень сильно упрощает работу.
У этой системы есть «старший брат» – полностью моторизованная система Evos M7000 – и два «младших брата» Evos XL Core и флюоресцентный и Evos FLoid.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
