История
История
Эта публикация отражает содержание доклада «Отказ от ультра-ВЭЖХ. Что купить на сдачу?», прочитанного на мультиконференции «Диаэм» 9 ноября 2022 года.
Заведующий лабораторией физико-химических методов анализа Томского государственного университета Владимир Сидельников рассказал о своеобразной «обратной стороне» ультрахроматографии — о том, в каких случаях она не является оптимальным решением.
Вместе с коллегами из «Диаэм» специалисты упомянутой лаборатории занимались подбором и определением характеристик хроматографов, которые представляет компания, чтобы убедиться, что все эти приборы точно будут работать у тех, кто их приобретет, и уже на начальном этапе понимать, какие нюансы могут обнаружиться у каждого из таких приборов, чтобы потрогать все это оборудование своими руками, а не слушать некие наставления от китайских партнеров.
Судя по тому, сколько ультрахроматографов сейчас эксплуатируется в различных лабораториях, убеждать в нужности и важности метода уже никого не стоит. Но всегда ли оправдано применение ультра-ВЭЖХ и можно ли добиться тех же результатов с помощью методик обычной ВЭЖХ?
Принципиальное отличие состоит в том, что в ультрахроматографии используются сорбенты с более мелким размером зерна (менее 2 мкм в диаметре). Метод характеризуется малым объемом запаздывания градиента, если говорить о строении самого хроматографа. Ультра-ВЭЖХ — это тонкие капилляры, обязательно уменьшенный объем ячейки детектора, чтобы соответствовать малому объему запаздывания и увеличить чувствительность.
Если взглянуть на каждое из этих отличий в отдельности, можно сделать вывод: в целом все эти отличия количественные! По сути немного уменьшен размер зернения сорбента, немного уменьшены капилляры (они стали тоньше), стали короче плунжера, миниатюрнее ячейка — и готово, создан новый метод.
Новый? На самом деле ультра-ВЭЖХ — это просто ВЭЖХ. И большинству это вроде бы понятно.
Если взглянуть на хроматограмму, полученную нобелевским лауреатом Винсентом де Виньо в 1955 году при разделении смеси 13 аминокислот, можно отметить далекое от идеала качество разделения. Например, в целом там будет ошибка определения второй и третьей кислот порядка 10 %. При этом в 1955 году на получение даже такой хроматограммы понадобилось 5 суток!
Впрочем, цель можно было считать достигнутой, и если не указывать всех нюансов, то результат можно было бы принять за вполне современный, выполненный на каком-нибудь 5-микронном сорбенте в короткой колонке.
Впрочем, наука не стояла на месте, менялась техника хроматографии, а задача осталась прежней. Через каких-то 17 лет Джек Киркланд на своей колонке Zorbax Sil с 8-микронным силикагелем и самодельном хроматографе также разделил аминокислоты.
Продолжительность проведения анализа составила 12 минут. Напомним, с момента получения первой хроматограммы прошло 17 лет, до нашего времени оставалось 50 лет.
По качеству еще есть претензии, компоненты 2 и 3 не особо делятся, валин (пятый) не разделился. Впрочем, возможно, и смесь была другой — однако решали схожие задачи и принципиально то, что продолжительность проведения анализа удалось сократить в 600 раз!
И это дает право говорить, что в ВЭЖХ произошел качественный скачок: было 5 суток — стало 12 минут.
Уникальность этого случая — единственного за всю историю хроматографии — в том, что ВЭЖХ сделал анализ дешевле. Это первый и, наверно, единственный раз, когда в хроматографии что-то стало дешевле с развитием.
Но возвращаемся в наше время: рассмотрим очередную хроматограмму, в которой уже несколько больше аминокислот, но задача та же — их разделить.
Разделение почти нормальное, но тоже не до базовой линии, и если все растянуть, то пики не будут похожи на пики в ГХ. Скорость проведения такого разделения составила 8 минут.
За оставшиеся 50 лет скорость разделения стала быстрее в полтора раза! И это дает понимание, насколько близко УВЭЖХ к классической ВЭЖХ.
При переходе от классической к УВЭЖХ не видно того, что можно было бы назвать качественным скачком.
Чтобы разобраться, как можно улучшить результат хроматографического разделения какой-либо смеси, нужно проанализировать основное уравнение хроматографии, которое в первом приближении отображает зависимость разделения от нескольких факторов.
Вот от чего зависит то самое разрешение между пиками, значение которого по фармакопее все хотят видеть на уровне не менее 1.5 (и которое определяет, нравится пользователю хроматограмма или не очень).
Первая переменная в уравнении — это N, эффективность, которая показывает насколько пики узкие. Понятно, что именно на эффективность напрямую влияет применение более мелкого зернения сорбента, которое в УВЭЖХ и влияет на эту величину N. Обратите внимание: в формуле N находится под корнем: значит, чтобы увеличить разрешение вдвое, значение N нужно увеличить в 4 раза.
Следующая величина, которая влияет на разрешение —это адсорбция, или удерживание. Это мера адсорбции в колонке, и на эту величину К` для одинаковых колонок можно влиять по сути составом подвижной фазы, двигая пики вправо и влево по хроматограмме.
Наконец, селективность α показывает различие удерживания, и влиять на нее получается чуть сложнее: в большей степени на селективность влияет выбор самой колонки: это может быть просто силикагель, С18 (октадецил, привитый на силикагель), силикагели, модифицированные другими функциональными группами и пр.
Итак, единственный коэффициент, который в уравнении находится под корнем — это эффективность. Как же формула работает в жизни?
Пример: так выглядит хроматограмма препарата, точнее субстанции под названием луликоназол. Для этой субстанции характерно наличие трех примесей. В нашем распоряжении есть хроматограмма, в которой за 12 минут удается решить задачу разделения этих примесей. Но в классической ситуации на хвосте пика основного вещества выходит примесь, разрешение явно меньше полутора.
Слушатели из зала предлагали следующие варианты:
Но если предположить, что хроматограф точно исправен и значение pH адекватно, то получается, что нужно просто взять другую колонку.
Возвращаясь к нашей теме (УВЭЖХ), отметим, что потребуется для перехода к ультра-ВЭЖХ в данном случае:
Вот так будет выглядеть хроматограмма: она характеризуется красивыми узкими пиками, но разрешения нет.
Чтобы добиться разрешения на уровне 1.5, придется снизить содержание ацетонитрила в подвижной фазе, причем даже не «чуть-чуть», а сделать 22 % ацетонитрила. При этом увеличился коэффициент К`, который отвечает за удерживание, и в итоге получается разрешение примерно полтора, то есть пик примеси полностью разделен до базовой линии.
Итого: разделение занимает все те же 12 минут, при этом тратится меньше ацетонитрила (это явный плюс), но скорее всего в такой системе высокое давление. Однако в принципе задача решена, методика сработала.
Понравится ли пользователю такое финальное разделение? Хотелось бы ему воспроизводить такую методику с разрешением полтора?
Ведь все-таки результат здесь находится на грани, и если колонка чуть подсядет и разрешение упадет, нужно сразу брать новую колонку и выбрасывать использованную. Но плюс такого решения в том, что «думать особо не нужно»: просто требуется взять колонку поэффективнее.
Минус такой методики в том, что если у пользователя нет ультрахроматографа, он не сможет достичь нужного давления. К тому же срок службы таких колонок обычно намного короче, поскольку даже небольшое проседание сорбента на входе довольно резко уменьшает эффективность колонки, на которую и делается вся ставка в методике.
Отметим, что такое решение существенно дороже.
То есть это решение рабочее, но есть нюансы.
А вот второе решение.
Для него потребуется взять колонку подлиннее, но с теми же параметрами.
Тогда то же разделение будет получено за 18 минут, время анализа увеличилось. Можно повлиять на эту ситуацию, если есть запас по давлению: если используется колонка 250 и соотношение ацетонитрила с водой составляет 50:50, скорее всего, запас еще есть. Если был поток 1 мл в минуту, можно увеличить его немного, до 1.7 мл/мин, и получить в принципе хроматограмму аналогичную результату УВЭЖХ.
Плюсы такого решения:
Колонка, кстати, будет «жить» дольше, чем колонка УВЭЖХ, потому что в ней по-прежнему используется 5-микронный сорбент, для производства которого технология отработана получше: небольшое проседание сорбента на входе не будет существенно влиять на эффективность.
Пожалуй, минус в этом решении только один: расход элюента вырос на 67 %, а при переходе к методике УВЭЖХ расход элюента упал.
Но есть и третье решение.
Было предложено взять другую колонку — повлиять на селективность, на α.
Конкретно для этого случая можно реализовать это следующим образом, оставшись при этом на сорбенте 5 мкм, на той же длине колонки и не увеличивая расхода растворителя и не увеличивая продолжительность анализа. Но получив разрешение порядка 2 и более, точно не 1.5 — с запасом.
Конкретно для этого препарата потребовалась замена колонки С18 на колонку «С18-арил». То есть вроде бы по сути решение простое — нужно только заменить колонку (не нужен другой прибор, не нужно менять условия, хотя на самом деле нужно). Проблема в том, что никто не знает, как это сделать.
В данном случае заменили С18 на С18-арил — это модифицированная колонка С18 с фенильными фрагментами. И такая колонка позволяет улучшить разделение многократно.
Пример: дана хроматограмма с четырьмя неподеленными пиками примеси. Можно при таком подходе получить отличное разрешение — на уровне 3, 6, 8, такого нельзя было добиться другими методами.
Какие проблемы есть у ВЭЖХ?Какие проблемы есть у ВЭЖХ?
В классической хроматографии мала эффективность и потому сложно добиться разрешения.В классической хроматографии мала эффективность и потому сложно добиться разрешения.
Пользователи хотят добиться большей эффективности и поэтому переходят на УВЭЖХ.Пользователи хотят добиться большей эффективности и поэтому переходят на УВЭЖХ.
Но только что на практических примерах было показано, что это решение не идеально и не всегда является оптимальным. Тем более что у УВЭЖХ есть ряд своих проблем вроде низкой удельной эффективности колонок, низкой пиковой емкости и пр.
Под удельной эффективностью подразумевается то, что уменьшение зерна сорбента не пропорционально приводит к увеличению эффективности.
Низкая пиковая емкость — не так много пиков можно уместить на одну хроматограмму.
Также в колонках затруднен теплообмен, поэтому нельзя использовать колонки большого диаметра. А использование колонок маленького диаметра, которое обычно оправдывается снижением расхода элюента, приводит к низкой емкости колонок.
Итак, методики на примеси тоже трудно воспроизводить на УВЭЖХ колонках, когда есть желание увидеть основной пик «в перегрузе», но чтобы примеси при этом все еще были видны.
Естественно, минусом можно считать и высокую цену на оборудование, в частности на колонки УВЭЖХ. Это тоже достаточно большая проблема.
Поэтому использование УВЭЖХ не по назначению, как считает автор доклада и его коллеги, выглядит так.
Хоть докладчик и «поругал» УВЭЖХ, этот метод имеет свои преимущества для конкретных применений, на самом деле он не так уж плох.
1. Для контроля полноты очистки, когда пользователю нужен нетаргетный ингредиент. Причем потребуется анализировать сразу несколько, группу препаратов на производстве в одних условиях. При этом необходима высокая чувствительность.
2. Биоаналитические и метаболомные применения, доклинические исследования лекарственных средств, когда важен анализ большого числа проб, выполненный быстро, потому что нельзя выделить большое время на длительный анализ условных «100 проб» не только из-за необходимости экономить время, но и потому, что пробы эти могут достаточно плохо храниться.
3. УВЭЖХ принесет немалую пользу в случаях, когда образца совсем мало и требуется высокая чувствительность — например, для нужд наркоконтрлоя, при изучении каких-то исторических реликвий, для поиска малых остаточных количеств веществ.
4. И конечно, УВЭЖХ просто незаменима в комбинации с масс-спектрометрией. «УВЭЖХ-МС» — это отличная комбинация, потому что растворители для масс-спектрометрии очень дорогие, на порядок дороже, чем классические растворители для УВЭЖХ, и здесь экономия растворителя действительно себя оправдывает.
Кроме того, многие масс-спектрометрические источники заточены под использование с низкими потоками, и это тоже позволяет отлично работать без деления потока именно на УВЭЖХ колонках.
1. Иногда вместо покупки аппаратуры для УВЭЖХ, если задача пользователя не находится в приведенном выше списке из четырех пунктов, для которых УВЭЖХ действительно необходима, лучше просто купить больше разных колонок, чтобы попробовать разные значения селективности.
Возможно, задача пользователя намного лучше, красивее и дешевле решится именно с помощью смены селективности. То есть нужно учиться работать с чем-то, кроме С18.
2. Колонок много не бывает: купите их еще больше.
3. Можно обучить своих химиков, чтобы они потом знали, что с этой «кучей колонок» делать.
Да, «куча колонок», лежащих на столе без химика, который понимает, как их использовать, абсолютно не имеет никакой ценности. Она не поможет, если проводить все эксперименты бездумно.
Можно порекомендовать при выборе курсов для хроматографистов ориентироваться на то, чтобы это были практические курсы, а обучение проходило не в гигантских аудиториях по 30–40 человек, когда невозможно задать какие-то свои вопросы и решить какие-то конкретные проблемы. Выбирать нужно курсы, которые помогают получать реальные навыки, а не какие-то «корочки».
Лаборатория физико-химических методов анализа Томского госуниверситета оказывает такие услуги по обучению специалистов.
Специалисты лаборатории сами занимаются разработкой хроматографических решений для фармацевтической отрасли, то есть разрабатывают методики, проводят их валидацию и трансфер, а потому на своем опыте знают, когда и какие подходы лучше использовать.
Лаборатория организует практические недельные курсы, в ходе которых специалистов фармацевтических компаний обучают необходимым знаниям.
Конкретно для того, чтобы понять, как правильно регулировать селективность, можно порекомендовать обратить внимание на курс по разработке методик анализа примесей в фармпрепаратах. В рамках этого курса пользователей учат тонко регулировать селективность, осознанно использовать полученные знания на практике и снижать риски при определении примесей, то есть думать, как методика будет воспроизводиться в отделе контроля качества, как она будет использоваться на заводе и как много денег она сможет сэкономить фармкомпании — или же это будет бестолковая трата ацетонитрила.
Организаторы курсов ориентируются на практические занятия, более 70 % времени которых занимает практика. Группы обучаемых составляют 5–6 человек: больше не набирают, поэтому все успевают задать свои вопросы.
В итоге зачастую обучающиеся уезжают после обучения с готовыми решениями своих проблем, которые на заводе у них не решались годами (то есть просто что-то не делилось, не выходило, методика воспроизводилась только в 50 % случаев и т. д.).
Здесь всегда стремятся дать навыки, которые понадобятся и пригодятся.
Подробности можно найти на сайте лаборатории http://lpcma.tsu.ru/education, на котором есть информация по этим и другим курсам. Через этот же сайт можно задать вопросы автору доклада.
Другие видео мультиконференции
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
