От биореактора до криобанка: как сохранить жизнеспособность клеток после наработки

Bioengine — это наш ключевой партнёр по средам. Компания работает с 2014 года и имеет все соответствующие сертификаты. У них среды выпускаются форматом 10 л в сухом виде. И они выпускаются именно для определённых уже клеточных линий.

Например, как среды для получения вакцин, тут есть и среды для клеточной и генной терапии, а также среды для наработки антител. Мы даём пробники на них. То есть, если вас заинтересовали эти среды, вы можете написать мне. У меня в конце презентации будут контакты. И, соответственно, мы можем дать вам попробовать эти среды.

Второй компонент — это вода. Вода — основа среды. Мы предлагаем полную линейку. Это, во-первых, такие системы на замену классических дистилляторов на основе фильтров. И также поставляемые системы получения воды второго и третьего и первого типа. Ну и пластик и стекло для культивирования, в чём будут расти клетки.

Есть и для адгизионных культур. Мы работаем c Jet Biofil и Nest, особенно по роллерным бутылям с Jet Biofil. Мы для суспендионного культивирования работаем с Nest.

Они предлагают различные бутыли: колбы Эрленмейера с отбойниками и без, с вентилируемыми крышками и без. Также мы поставляем различные вот такие крышечки, бутыли, и вот на замену, например, целлюлозных крышек ватных пришли вот такие вот плёночки.

Дышащие плёночки. И также помимо пластика, у нас есть и стекло, это Glassco. У них тоже есть различные виды колб Эрленмейера, матрасы стеклянные, пробирки и так далее. Само культивирование как бы происходит в определённом оборудовании.

Из линейки оборудования мы, во-первых, предлагаем шейкеры-инкубаторы производителя Labwit австралийской компании. Они предлагают настольные варианты: горизонтальные, двухуровневые платформы, штабелируемые. Штабелируемые есть как и бактериальное культивирование, так и культивирование растений и клеток эукариоз с 2Е влажностью. Уникальной фишкой шейкеров-инкубаторов является плавная регулировка амплитуды до 50 мм.

Мы их даём на демо, то есть мы с ними работаем уже больше трёх лет, поэтому будем также выставлять большой шейкер-инкубатор на мультиконференции у нас, приходите, можно посмотреть.

Как альтернатива большому шейкеру-инкубатору мы предлагаем шейкер СО2 — инкубатор, который выдерживает до 20% концентрацию СО2 и при этом не окисляется, и электроника у него не летит.

Сами СО2 инкубаторы. И есть большие, если нужно накультивировать в большом количестве культуры, то есть вот такой вариант двухуровневых платформ и шестиуровневых платформ. Ну и, конечно, мы предлагаем сами биореакторы и даём на демо лабораторные модели. Их предлагаем именно вот, которые классические с мешалкой на демо.

Также у нас есть различные биореакторы: и волновые с одноразовыми мешками, вертикальные с мешками до 2 000 л и остальные стерилизуемые паром. Вот вертикальные с мешками мы в прошлом году на Фармтехе выставляли для демонстрации.

Из новинок таких интересных для R&D, может быть интересны биореакторы для параллельного культивирования. То есть здесь такие маленькие биореакторы, как и для бактериального и культивирования Эокариот.

В маленьком формате для того, чтобы можно было быстро проверить эффективность различных штаммов и клеток. И также для разработки, оптимизации сред, выбора сред, процесса культивирования. Они есть как со стеклянными сосудами, многоразовые, так и с одноразовыми сосудами. И вплоть до таких маленьких биореакторов можно поставить до 96 штук параллельно по восемь групп. То есть здесь вот эти одноразовые сосуды, они одноразовые.

Как и сам биореактор, мы предлагаем, он не может работать как бы без обвязки, без сопутствующего оборудования, поэтому мы предлагаем и чиллеры к нему подбираем, и воздушные компрессоры, и кислородные концентраторы.

Есть у нас также автоклавы для стерилизации биореакторов, причём с подъёмным механизмом. Есть корзина, в него загружается биореактор, и как бы этот подъёмный механизм поднимет вам биореактор и опустит в автоклав.

То есть не нужно будет всё это вручную поднимать и надрывать спину. Также у нас есть и мелочи для биореакторов. Это и колбы для подпиток от компании Glassco Индия, крышечки для подпиток различного вида с различными портами, одноразовые порты и шланги, термопластичные, классические, обычные. При работе с биореактором важно сохранить стерильность.

Здесь незаменимые будут системы для работы для спаивания и запаивания трубок. У нас есть спайщик шлангов от компании Applitech, причём у него лезвия подходят к системе спайки Sartorius. Мы проверяли несколько раз, то есть убедились в этом. Также есть запайщики шлангов, как и формата такого большого, который можно повесить на биореактор из нержавеющей стали, так и небольшого формата ручного, который работает автоматически

И если у вас, например, шланги, которые не термопластичные, то есть вот такие обрезатели шлангов на которые одеваются кольца, и затем этот абиокатор его перерезает и зажимает этими пластинами. И получается у вас стерильный разрез шлангов, которые не термопластичные.

Так, культура растёт, но нам обязательно нужно проконтролировать, всё ли в порядке с нашей клеточками, то есть живы они там, истощилась ли питательная среда или, наоборот, не накопились ли метаболиты, которые будут токсично на неё влиять. Из решений мы предлагаем вот такие анализаторы метаболитов и состава состава среды, в которых можно смотреть все параметры питательной среды: и глюкозу, и перуват, и ионы, мочевину, также контролировать накопление метаболитов.

Классический — это лактат, аммиак, также можно смотреть уксусную кислоту. И даже есть продукты некоторые, например, человеческий IgG или мышиный. Из такого компактного формата есть анализатор только глюкозы, например, для анализа истощения глюкозы в среде.

И для биореакторов классикой является датчики Гамильтон которые могут мерить общую плотность клеток, жизнеспособность клеток сразу же в биореакторе, PH, глюкозу, растворённый кислород. При этом они автоклавируемые. Как альтернатива, можно использовать для рутинного контроля микроскопы.

Как альтернатива, можно использовать для рутинного контроля микроскопы.

То есть у нас есть прямые микроскопы Magus, инвертированные микроскопы и также вот такая вот система онлайн-мониторинга для адгезивного культивирования в CO2-инкубаторы. То есть альтернатива инвертивному микроскопу, при этом вся информация будет выводиться на компьютер. Самый важный параметр, является это количество количество живых клеток и жизнеспособность клеток.

И альтернативы датчику в биореакторе в жизнеспособности мы предлагаем такие вот счётчики клеток, которые можно посмотреть при отборе проб, например, из биореактора или шейкера инкубатора. У нас есть счётчики клеток RVD довольно-таки рабочая лошадка, из особенностей слайды от RVD подходят Countess Thermo то есть мы проверяли, если у вас, например, стоит Countess второй, то можно использовать недорогие качественные слайды от RVD.

Если у вас требуется IQ и валидация, у нас есть как альтернативные счётчики клеток Applitech. При этом они отличаются от счётчиков RVD тем, что у них есть свой, слайд и флюоресценция по пропидий йодид и акридиновому оранжевому (AO) в специальной технологии.

Ну и если вам нужен более подробный анализ, то можно всегда использовать проточную цитометрию с окрашиванием пропидий йодида и смотреть и клеточный цикл. Для отслеживания апоптоза и количества мёртвых клеток. Итак, вот мы перешли к самому главному.

Во-первых, нужна особая посуда. Это Криопробирки, которые выдерживают и -80° и пригодны к хранению в азоте.

У нас есть пробирки различного объёма, как от одного до 10 мл. Обязательно выбираются крышечки от ваших потребностей, там с внешней или внутренней резьбой: конические, круглодонные, устойчивые или без юбки. Один из вариантов, вот новинка у нас — это криогены вялые из циклофинилового полимера для хранения образцов именно в азоте. Они прозрачные, химически инертные, идеальны для клеточной терапии.

И если у вас клетки в большом объёме нарабатываются, то есть криомешки специальные, вот от одного до пятидесяти литров с такими вот кассетами для замораживания и оттаивания. Эта кассеты нужны для того, чтобы мешки не продавливали друг друга, то есть хранились вот в таких кассетах в целостности и сохранности. И в них можно и замораживать, и оттаивать.

Помимо криопробирки вам нужно подготовить среду для замораживания. Добавить криопротекторы, чтобы у вас клетки не разорвало от кристаллов, образовавшихся при замораживании внутри клетки. Классикой является DMSO — протектор для клеток млекопитающих, до 10% обычно ему добавляют. Как варианты, есть глицерин, этилингликоль, пропилингликоль.

Делается это всё на сыворотке для приготовления криосреды. Там тоже подбирается экспериментально процент. В некоторых случаях можно добавить декстрозу, декстран как защитный агент, который понижает немного токсичность DMSO при разморозке. И если вы не хотите готовить сами среды для заморозки, можно уже использовать готовые среды для заморозки Servicebio. Они есть как с DMSO, так и без DMSO

Как не перепутать такое количество пробирок, если у вас наработалось большое количество клеток и мы раскапали их? Применяется маркировка. Конечно, всегда классикой является перманентный маркер, но если у вас очень большое количество пробирок, то можно запутаться.

Для автоматизации можно применять принтер Brady с наклейками, которые выдерживают до -196°C, при этом они не разваливаются, не отклеиваются, с чётким нанесением печати. Из новинок появилась такая лазерная система для маркировки Service Bio. То есть она наносит гравировку прямо на пробирку, её невозможно будет стереть.

То есть это вырезается именно на самих пробирках, на различной посуде. И для отслеживания по наклейкам и по лазерной системе( в лазерной системе можно наносить не только буквы, но ещё и QR-коды и штрих-коды), и в дальнейшем можно использовать такие сканеры для крио-пробирок, для считывания образцов, чтобы они автоматически у вас в базу заносились, и не нужно было это вручную всё писать.

Итак, мы подготовили пробирки, подготовили среду, промаркировали пробирки. Теперь нужно раскапать, соответственно, клеточную суспензию, при этом нужно сделать это асептически. Как вариант, для автоматизации для крио-банков мы предлагаем вот такую систему розлива в крио-пробирки.

Она упрощает работу при большом количестве пробирок. Она сама вам открутит крышечки с пробирки, зальёт туда клетки и закрутит крышечки.

Здесь используются одноразовые системы для разлива. После её использования она выкидывает из системы стерильные пластиковые трубочки, через которые будут заливаться клетки.

Эту систему можно подключить как и через Мама-папа, так и c помощью спайщика-запальщика к вашей культуре клеток. Сама культура ставится для перемешивания на шейкер для того, чтобы не осели клетки и было всё равномерно. После этого заполняются трубки до начала розлива.

Загружаем наши пробирки. Пробирки могут быть любые, то есть у них есть стандартные варианты, какие можно использовать пробирки, но эту систему можно настроить и под ваши варианты пробирок. Как и с внешней, так и с внутренней стороны. То есть в самом ПО оно автоматически будет настроена. Вы выбираете вид пробирок, который вы загрузили. Можно все параметры настроить.

Как и скорость розлива, объём розлива, с какой пробирки начинать, сколько количество пробирок заполнить, не заполнить, то есть всё это настраивается. Всё довольно быстро, юзер-френдли. Потом вы включаете просто одну кнопку нажимаете, и система сама всё за вас сделает.

Система сама развивается пробивки. Довольно быстро происходит. Опять же потом возвращают назад и закручивает крышечки назад.

Есть ещё система для фасовки в мешки, если вы использовали виалы , вот именно вот такие большие криогенные виалы от компании CytoNiche.

У них в этот модуль большой встроенный системы для перемешивания клеточного продукта с контролем температуры. Затем идёт модуль самой фасовки виалы до 10 мл. Переходим непосредственно к процессу заморозки. Мы подготовили, заполнили пробирки, готовили всё к заморозке.

Теперь самое важное — это проконтролировать именно сам процесс заморозки. То есть нельзя просто пробирки с криопротектором поставить в морозилку. Там будет очень нестабильная заморозка. И оптимальная скорость заморозки для клеток является 1°C в минуту.

То есть, если быстрее, то произойдёт внутриклеточное образование внутриклеточных кристаллов льда, если медленнее клетки могут погибнуть от осматического шока. Поэтому есть такие специальные системы для заморозки, которые обеспечивают условия постепенного понижения температуры для аккуратной заморозки клеток. Мы будем идти от простого до самого технологичного.

И первое — это самый простой способ заморозки — штатив для замораживания. Он как раз за счёт своей конструкции кольца и материала обеспечивает равномерную скорость заморозки 1°C в минуту и в него загружаются пробирки, и он ставится в морозильник. По инструкции где-то 4 ч, но обычно по классике его оставляют на ночь.

У них в этот модуль большой встроенный системы для перемешивания клеточного продукта с контролем температуры. Затем идёт модуль самой фасовки виал до 10 мл. Ну, переходим непосредственно к процессу заморозки. Всё у нас мы подготовили, заполнили пробирки, подготовили всё к заморозке.

И потом с утра вытаскивают штатив этот, пробирки загружают уже в азот в сосуд Дьюара , а сам штатив оставляют при комнатной температуре, дабы он до следующей заморозки, чтобы он дошёл до комнатной температуры, оттаял для использования при следующей заморозке. Вот так вот выглядит график постепенно. За 4 часа он проведёт замораживание. Более технологичные, ну, то есть, и в принципе замораживание со штативом результаты вполне сравнимы с такими вот программируемыми замораживателями.

Но если вам нужен именно полный контроль и проконтролировать, так сказать, получить протокол заморозки в виде чека, то здесь используются программные замораживатели. Диапазон у них температурный от +50 до -180. Можно использовать, замораживать как пробирки, так и соломинки, трансфузионные мешки. Мы предлагаем системное замораживания от Haier, и в комплекте с ними идёт сосуд Дьюара для как раз-таки подачи азота со шлангом.

И принтер встроен. После завершения программы заморозки, либо после, например, замораживания в штативе, образцы отправляются на долгосрочное хранение.

Здесь у нас есть CryoBio. Мы предлагаем от Haier как оптимальный вариант для лаборатории. Это новая автоматическая система криохранилища с автоматической дозаправкой.

Испарение жидкого азота в рабочем режиме у него составляет полтора литра в день. Есть цветной дисплей, который позволяет работать в перчатках, то есть он это всё нормально переносит на экран. Есть протоколирование данных работы прибора, функция удаления тумана жидкого азота при открытой крышке. Ну и в стандартную комплектацию входит как шесть штативов по десять крео-пробирок.

Ну и, соответственно, для автоматической дозаправки сосуда Дьюара можно подключить точнее, к креохранилищу можно подключить сосуд Дьюара. Есть более технологичный вариант — это система хранения с автоматической уже дозаправкой. То есть, если там нужно подключать азот.

Cама конструкция крышки исключает образование инея на горловине, у него интегрированная крышка, сенсорный дисплей, bypass на линии заполнения жидким азотом. И есть также протоколирование данных.

Также мы предлагаем такие большие системы хранения. Ну, для биотехнологических производств, то есть тут уже объёмы от 350 до 1880 литров, большие системы криохранилища. Также есть подпитка от азота.

В него встроена система Cryosmart LN2, обеспечивающая управление и контроль сенсорного дисплея, причём на нём можно работать в перчатках. И карусель для крио-штативов. Также можно подключить режим автозаполнения азотом.

Также, если хранение в азоте — это надёжно, но если у вас, например, образцы хранятся при минус 40°C или просто временно, нужно клетки сохранить там до проведения эксперимента, то есть и холодильники для образцов с такой новинкой RFID-метками. То есть суть в том, что вам не нужно будет ввести как бы для заполнения данных вам можно будет использовать вот такой принтер, который распечатывает RFID-метки. Они приклеиваются на образец.

Затем, когда вы заносите образец в холодильник, холодильник сам автоматически заносит, как бы вот здесь вот на экране в свою базу образец. То есть показывает, что образец, например, был взят или образец вернули на место и где он находится. Такие морозильники скоро выйдут. А пока сейчас есть холодильники от 2° до +8°C с большим объёмом 639 л у Haier.

Путь замыкается на разморозке образца, если для использования в каких-нибудь экспериментах либо наработках и тут важно правильно также разморозить клетки, чтобы они сохранили свою жизнеспособность.

После заморозки можно, конечно, использовать классическую водяную баню с подогревом, но само ручное размораживание в этой водяной бане часто может привести к перегреву клеток у стенок пробирок, пока сердцевина ещё холодная. А в данном решении

Во-первых, оно позволяет контролировать, протоколировать процесс разморозки.

Во-вторых, вот это вот обеспечивает равномерное оттаивание без перегрева. Эти вот модели ThawHome от Kemesser. Они рассчитаны на небольшое количество пробирок, то есть максимум четыре криопробирки. Также есть модели для одного пакета. Мы прошли с вами от этапов наработки для культивирования клеток до процесса подготовки заморозки, самой заморозки и размораживания клеток.

То есть важно на каждом этапе проконтролировать жизнеспособность клеток. Обязательно подобрать оборудование правильное и условия заморозки. Криопротекторы, среды для заморозки. Перед этим, проверить, что у вас после наработки клеточная линия живая, посчитать её количество и запротоколировать жизнеспособность.