История
История
Содержание статьи:
Thermo Fisher Scientific предлагает пользователям наряду с приборами широкий спектр реактивов, в том числе тест-системы (эссеи) и Мастер Миксы.
Они могут быть использованы во всех исследованиях с применением технологии «реал-тайм» – например, судмедэкспертиза, тестирование качества и безопасности
В ассортименте компании – порядка 19 миллионов тест-систем под различные «снипы», экспрессионные системы, системы для копийности генов.
Огромный опыт производства реактивов в полной мере реализован в тест-системах TaqMan. Марка «Такман» осталась в распоряжении Thermo Fisher даже после того, как у Roche закончился патент на это название, но именно TaqMan на сегодня является золотым стандартом в генетическом анализе.
Если забить в NCBI TaqMan, можно найти огромное количество ссылок на Applied Biosystems, Life Technologies, Termo Fisher Scientific в зависимости от даты статьи.
В первую очередь производятся наборы для генотипирования в двух вариантах: обычный и для генотипирования метаболизма лекарственных ферментов и веществ, анализа экспрессии генов, для анализа копийности генов, для конкурентной аллельспецифической ПЦР, применяемой в первую очередь в онкологии. Кроме того, выпускаются наборы для изучения микроРНК и мелких РНК, некодирующих нуклеиновых кислот и т. д.
Еще один вид продукции – наборы для изучения белков, хотя эта тема в принципе не востребована: люди, занимающиеся блоттингом, по-своему верифицируют полученные белки непосредственно в «реал-тайм».
Это «золотой стандарт» чувствительности.
Это «участники» огромного количества публикаций. Если вы публикуете свою работу в профильном журнале и пишете «TaqMan», у рецензентов обычно нет претензий на предмет доказательной базы результатов исследования.
При их использовании нет необходимости валидировать и оптимизировать условия. Любую генотипирующую, экспрессионную систему можно поставить в один реакционный блок, они будут идти по одной программе. Они готовы к использованию.
Если они не работают, мы хотя и не вернем деньги, но попросим вас выбрать другую тест-систему или заменим на существующую, если она не работает по нашей вине.
Эффективность амплификации гарантирована: если вы получаете этот набор, он стопроцентно работает. Набор стоит дороже, чем сумма заказанных отдельно праймера и зонда, но нужно понимать, что, если заказаны отдельно праймер и зонд, то есть риск, что они не сработают. Тогда придется выбросить приготовленные смеси и готовить заново всю систему. Если мы беремся за составление системы, вы получаете готовую конструкцию, и на производстве есть выходной контроль качества. Компания информирует заказчика, если тестирование показало, что тест-система не работает по той или иной причине, и предлагает другое решение.
Есть два направления:
TaqMan для ДНК – это наборы для генотипирования, кастПЦР, копийность.
TaqMan для работы с РНК – экспрессия и анализ микроРНК.
Если говорим о генотипировании или экспрессии, всегда возникает вопрос, что выбрать: использовать интеркалятор или TaqMan зонд?
У тех и других есть сторонники и противники. В случае TaqMan зонда это будет дороже, но более специфично. В случае интеркалятора это будет менее специфично, но существенно дешевле. Выбор остается за пользователем.
Все зонды TaqMan для наших тест-систем имеют так называемую MGB – это небольшая белковая молекула, которая «заякоривается» в малую бороздку нуклеиновой кислоты, плотно связывает зонд с нуклеиновой кислотой и позволяет при этом производить лучшую дискриминацию. Это позволяет сделать зонд коротким – порядка 16 нуклеотидов вместо 25-30 обычных, позволенных для зонда. Короткий зонд не страдает с точки зрения отжига: отжигается нормально при 60 градусах.
Зонды также содержат нефлуоресцентный гаситель, который позволяет лучше дискриминировать сигнал и шум. Это позволяет лучше прочитывать АТ-богатые участки, куда можно «посадить» зонд, а также выбрать участок с мутацией в зоне достаточно вариабельной: чем меньше зонд, тем проще его «посадить» на вариабельную зону, в отличие от длинного зонда, который будет «отклеиваться».
Заказчик и получает такую конструкцию.
- в формате одной пробирки, если заказано определенное количество пробирок под определенное количество мутаций – в пробирке будут содержаться меченые зонды и праймеры в растворе в определенной концентрации,
- если большее количество образцов и большее количество мутаций, можно говорить о форматах либо 96 – 384, либо TaqMan Array карта, если у вас 48 точек есть на образец. Тогда пользователь получит набор лиофилизированных 96-луночных плашек (например).
- если мы говорим об OpenArray и у нас много точек и много образцов, такой формат самый дешевый из всех: цена получается порядка 20 центов за точку, за снимок. Пользователь получает набор слайдов OpenArray с лиофилизированными тест-системами внутри, в которые нужно добавить Мастер Микс и образец. Многие лаборатории как раз для таких целей и используют этот формат.
Но если у пользователя не очень большое количество точек и небольшое количество образцов, то использовать OpenArray нет никакого смысла.
Все упомянутые тест-системы можно найти на сайте Thermofisher.com: в окно поиска заносится информация, связанная с тем или иным SNP.
Вбить можно RS номер, если он есть, или название гена – тогда в качестве результата будет выведено количество доступных тест-систем: экспрессионных, генотипирующих, на копийность генов. Будет еще и дополнительная информация.
Если в базе не найдется того, что задал пользователь, то результатом будет запись, что в секвенировании по Сэнгеру найдено столько-то праймеров, и это значит, что тест-систему можно изготовить только методом капиллярного электрофореза.
Если вы нашли набор и точку, которые вас интересуют, всю информацию можно получить, щелкнув (если вас интересует генотипирование или экспрессия) по ссылке. Открывается окно с большим количеством разных ссылок на наборы, вы находите свой и предоставляете поставщику ссылку на Assay ID – внутренний ID, на основании которого мы распознаем ту или иную систему.
Есть возможность выбора красителя, количества реакций: можно выбрать от S до L, «как в магазине» – от меньшего количества до большего. В случае, если это экспрессия, в файле по экспрессии будет ссылка «Связанные реагенты» с указанием комплекта для получения кДНК и Мастер Микс, а также ссылка на «контроли», которые понадобятся для рекомендуемой нами экспрессионной системы.
Более того, можно посмотреть всю информацию по данному набору в деталях, генную карту – там будет отмечено, где этот набор находится. Если вы знаете, с чем работаете, то спокойно сориентируетесь во всем. Все ссылки рабочие, они ведут на международные базы данных, поэтому найти что-то и проверить – это всегда просто.
Все наборы TaqMan адаптированы не только под приборы Thermo Fisher, но и под конкурентные –BIO-RAD, ROCHE, поэтому можно спокойно использовать их на приборах других производителей.
Если вдруг по какой-то причине набора, который вас интересует – SNP, экспрессионной конструкции – нет в нашей базе данных, но у вас есть последовательность нуклеиновой кислоты, внутри которой находится искомая мутация или искомая конструкция – вы можете всегда заказать «кастомную» конструкцию, мы ее сварим и сообщим, работает ли она. В таком случае вы ее получите в виде пробирки с праймерами, зондом либо двумя зондами в зависимости от системы. На сайте можно найти и информацию и о кастомизированных наборах TaqMan.
В первую очередь это применяется в популяционной и спортивной генетике, в ассоциации с различными заболеваниями, если мы говорим о каких-то скринирующих процессах, в анализе метаболизма лекарственных веществ. Большое внимание уделяется сельскохозяйственным моментам, биологии – это чистота породы, различные селективные свойства, урожайность, устойчивость к пестицидам и так далее. ДНК-маркеров много, сейчас такие исследования набирают популярность.
Следующее направление – это ответвление генотипирования, так называемая конкурентная аллельспецифическая ПЦР, или кастПЦР. Разработана она в первую очередь для детекции онкологических мутаций, присутствующих в <0,01% cлучаев. Наборы TaqMan Mutation Detection Assays для кастПЦР могут быть использованы в цПЦР.
В данном направлении есть у компании решения под «реал-тайм». Не все решается цПЦР, есть подходы, с помощью которых можно сделать решения «реал-таймом». У нас есть перечень мутаций, для которых есть тест-системы в таком случае. Так оценивают соматические мутации в генах, ассоциированных с канцерогенезом. Совместимы они с различными типами материалов, позволяют «вытащить» ДНК оттуда.
Это работает достаточно просто: есть аллельспецифический праймер, локус-специфический праймер, есть зонд, есть блокатор. Локатор садится на «дикий тип» и не позволяет «дикому типу» амплифицироваться.
Амплифицируются только мутантные молекулы. Система позволяет оценить их присутствие количественно при наличии определенных дополнительных реагентов и получить результат даже по количественной нагрузке данной мутации.
Что касается нуклеиновых кислот, это в первую очередь мы говорим про экспрессию в контексте ДНК, генотипирования.
Эту важную тему нужно затронуть, потому что микроРНК является очень хорошим регулятором.
В последнее время мы видим рост интереса к микроРНК. На слайде показано, как микроРНК регулирует процесс трансляции. Если транскрибировалась некоторое количество мРНК, это не значит, что мы получим соответствующее количество функционального белка: микроРНК заблокирует трансляцию, и мы на выходе не увидим аналогичное количество белка, которое изначально транскрибировалось в матричную РНК.
У Thermo Fisher на сегодня есть два набора для изучения нуклеиновых кислот.
Это классический набор для анализа микроРНК, сделанный на основе петлеобразного праймера, который «садится» на микроРНК, дальше получается кДНК и дальше мы проводим «реалтайм».
Важно, что праймеры садятся только на зрелую микроРНК, не на прекурзоры. Тогда происходит обратная транскрипция, и дальше – «реал-тайм».
Мы говорим об этом наборе, если количество микроРНК, которое вас интересует, варьирует в пределах 10-15, максимум 20: кит включает в себя и кДНК, и кит для реалтайма. Это две пробирки: одна для снятия кДНК, другая для амплификации.
В случае если количество микроРНК, которое вас интересует, больше, чем 15-20, то работать с такими вещами не очень удобно. Поэтому мы разработали новый кит, который называется TaqMan Advanced микроРНК.
Состоит он из двух частей, покупаются они отдельно.
1 – это TaqMan Advanced микроРНК кДНК синтезирующий кит – особенность его в том, что он превращает в кДНК всю микроРНК, которая находится в образце.
2 – отдельным китом под отдельные РНК вы можете «поднимать» их при помощи «реал-тайм». Поэтому если у вас порядка 30-40 микроРНК, которые вы хотите посмотреть на пациентах, то проще всю РНК снять одним китом, а дальше уже отдельными тест-системами смотреть данную микроРНК.
Преимущества этого кита:
Высокая чувствительность: «вылавливает» до 60 копий; требуется всего 2 мкл плазмы или сыворотки; это «Золотой стандарт»: если не будет работать, мы вам его заменим. Он обладает наилучшей специфичностью в данном случае.
Мастер Миксы приобретаются отдельно в соответствии с нашими рекомендациями. У нас есть большое портфолио Мастер Миксов под различные задачи: под ДНК, под РНК, под ДНК- и РНК-экспрессию, One-step реалтайм, интеркалирующие.
В первую очередь отличаются они производителем.
Часть Мастер Миксов исторически относится к Applied Biosystems, часть – к другим компаниям (например, Fermentas, ABgene). Они немного отличаются по составу.
Мастер Миксы Applied Biosystems включают ДНТП, магний, буфер, полимеразу, урацилДНКгликозилазу, референсный краситель. В качестве трифосфата они используют только урацил, поэтому они все контаминационно безопасны.
Если мы говорим о Мастер Миксах от других производителей, то возможны варианты: смесь тимина с урацилом, в некоторых присутствует, в некоторых отсутствует урацилДНКгликозилаза, референсный краситель в некоторых добавлен, в некоторых идет в отдельной пробирке.
Вариант можно подобрать в зависимости от цели и бюджета.
На сегодня мы активно позиционируем 4 основных Мастер Микса.
Для экспрессии генов и микроРНК рекомендуется очень чувствительный TaqMan Fast Advanced Master Mix.
Для генотипирования мы рекомендуем два мастермикса: TaqPath ProAmp Master Mix и Genotyping Master Mix, и он наиболее востребован. А TaqPath можно использовать, если у вас сложная матрица и какие-то проблемы с амплификацией с обыкновенным Мастер Миксом – например, его не хватает по чувствительности. Он устойчив к ингибиторам – если, например, не дочистили гемоглобин и т.д., то можно этот Мастер Микс использовать.
Если мы говорим о классической амплификации как о молекулярной диагностике – это TaqMan Fast Virus 1-step Master Mix, можно его использовать под любую РНК матрицу, если просто нужна детекция.
И если вы работаете с интеркаляторами, то у нас есть большой список интеркалирующих Мастер Миксов. Наиболее популярны из них и обладающие наибольшей чувствительностью и специфичностью – это PowerUp SYBR Green Master Mix, в нем же есть новая полимераза, заблокированная двукратно. Если вы раскапали реакционную смесь и оставили ее на столе, например, забыли на выходные и пр., он спокойно простоит, в нем не произойдет никакая амплификация, и после довольно длительного перерыва его можно поставить амплифицироваться. Он выдерживает до 72 процентов уже в системе, готовой для амплификации, и не амплифицирует.
В январе 2020 мы выпустили новый мастермикс для интеркалирования SYBR, он состоит из двух частей – желтого и синего буферов.
Эта идея не нова, но компания такое сделала первый раз. ДНК, с которой вы работаете, разводится желтым Мастер Миксом – желтым буфером, а далее, когда вы готовите какую-то, например, экспрессионную панель из большого количества образцов, добавляете синий Мастер Микс и ваш реагент становится зеленым внутри. Вы фактически отслеживаете то, куда добавили смесь и куда не добавили. Этого можно не делать, если у вас небольшое количество образцов, но, если вы работаете с плашкой, это полезная опция.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
