Основы количественной и цифровой ПЦР. Применение в практике. Подходы к выбору технологии и реактивов. Часть 1

(на основе выступления менеджера по развитию бизнеса кПЦР компании Thermo Fisher Scientific Алексея Пазилина)

• Решения для генетического анализа
• Thermo Fisher Scientific: краткая характеристика производителя
• ПЦР в реальном времени
• Области применения кПЦР
• Приложения для кПЦР
• Реализация технологии кПЦР («реал-тайм»)
• Устройство приборов для технологии «реал-тайм»
• Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»
• Калибровка приборов
• Пассивный краситель и его функция

Решения для генетического анализа

Сегодня для решения задач генетического анализа существует несколько направлений – NGS, КЭФ, кПЦР («реал-тайм»).

Практика показывает, что пока нет технологии, которая бы в равной степени успешно решала все задачи, и нет прибора, который бы делал все подряд.

Определенные задачи решаются с помощью дорогостоящего NGS, но в таком случае потребуется много образцов для запуска, чтобы стоимость анализа за одну точку оказалась адекватной. При этом нужно помнить, что чувствительность NGS не всегда достаточна.

Для подтверждения NGS нужно капиллярное секвенирование; если есть какие-то готовые SNP («снипы») или нужно посмотреть экспрессию отдельных генов, то проще это делать по технологии «реал-тайм». А если нужно посмотреть много точек или образцов, то приходят на подмогу микрочипы.

Thermo Fisher Scientific: краткая характеристика производителя

Это глобальная компания с большим оборотом, которая продолжает приобретать другие компании в своей сфере деятельности. На сегодня она представлена несколькими дивизионами. Один из них – Life Solutions Group – «Группа по науке о жизни», которая является продолжением Life Technologies [Corporation], Invitrogen, Applied biosystems и так далее. И представляемые ею бренды зарекомендовали себя в течение долгого времени: ThermoScientific, Applied biosystems, Invitrogen, Gibco, Iontorrent.

В их состав входит множество микробрендов, которые в свое время являлись самостоятельными компаниями.

Так, в 2020 г. оформили бренд Affymetrix (одноименная компания была куплена в 2015 г.) по производству микрочипов. Теперь это Applied Biosystems. В 2020 г. компания QIAGEN (Кайджен) начала путь к тому, чтобы стать частью Thermo Fisher.

До середины 2021 г., когда сделка по покупке этой компании закроется официально, QIAGEN и остальная часть Thermo Fisher функционируют как разные организации, Thermo Fisher не продает существующую продукцию QIAGEN и не вмешивается в его бизнес, т.е. до закрытия сделки оборудование QIAGEN продает тот, кто продавал его прежде.

Thermo Fisher представляет на рынке много продукции и покрывает его примерно на 80%.

ПЦР в реальном времени

Количественная ПЦР – она же «реал-тайм ПЦР», кПЦР – это технология, позволяющая автоматически детектировать амплификацию на каждом цикле без участия оператора и каких-либо рисков.

У «реал-тайма» огромное количество преимуществ по сравнению с «классической» ПЦР.

• Главное из них – это формат, в котором можно вести обработку. Это важно с точки зрения производительности лаборатории. Например, классический ПЦР на элекрофорезе позволяет использовать скорее всего 96-луночные планшеты, максимум – с 384 лунками, это неудобно. В «реал-тайме» можно подключать и 384-луночные планшеты, и OpenArray формат – собственную технологию от Thermo Fisher.
• Динамический диапазон «реал-тайма» существенно больше, чем в электрофорезной классической ПЦР.
• Меньше и рисков для персонала в силу отсутствия необходимости окрашивания нуклеиновой кислоты бромистым этидием – канцерогеном.
• «Реал-тайм» демонстрирует большую производительность и требует меньших затрат времени.
• Удобство и возможность автоматизации процесса (без участия самого оператора)

Области применения кПЦР

• «Реал-тайм» в первую очередь применяется для генотипирования, которое на сегодня везде активно ведется с точки зрения анализа нуклеотидных полиморфизмов, однонуклеотидных делеций и инсерций;
• Анализ метилирования;
• Анализ экспрессии и определение копийности генов;
• Анализ трансгенности (прикладное значение: анализ на отсутствие ГМО);
• Анализ на определение химеризма в медицине (в частности, посттрансплантационного);
• Качественный и количественный анализ ДНК в криминалистике, что очень востребовано в настоящее время;
• Контроль качества (например, контаминационный контроль – в пищевом, фармацевтическом производстве и т.д.)
• Количественное и качественное определение патогенов в инфектологии – молекулярная диагностика, которую проводит огромное количество компаний в связи с появлением новой коронавирусной инфекции в частности;
• Биобезопасность – опять же с точки зрения контроля качества различных продуктов.

По сути «реал-тайм» и стандартная ПЦР – это одна и та же система, только туда добавлены еще зонды. Но «реал-тайм» рассчитана на небольшой фрагмент с количеством нуклеотидов от 90 до максимум 250. Поэтому в данном случае стоит говорить о детекции, но не об амплификации длинных фрагментов.

Приложения для кПЦР

Если говорить о направлениях и отраслях, где применяется кПЦР, нужно назвать:

• Персонализированную медицину (фармакогеномику) различного рода – здесь используются «снипирование», генотипирование, анализ копийности генов;
• Изучение наследственных заболеваний – здесь тоже используются «снипирование» – SNP генотипирование;
• Разработку лекарственных средств – анализ экспрессии микроРНК и матричных РНК, анализ «переваривания» (метаболизма) лекарственных веществ и работу цитохромов, генотипирование;
• Ассоциацию биомаркеров с различными заболеваниями (в данном случае тоже важна экспрессия мРНК и микроРНК);
• Исследования, посвященные инфекционным заболеваниям, в частности качественный анализ, связанный с ними;
• Сельскохозяйственные технологии: немаловажная роль и в этой отрасли в последние несколько лет отводится генотипированию, качественному анализу, анализу экспрессии генов.

Реализация технологии кПЦР («реал-тайм»)

Для проведения кПЦР необходимы:

1 – прибор;

2 – управляющий компьютер или компьютер, на котором происходит анализ;

3 – программное обеспечение, которое позволяет работать с этим оборудованием.

Устройство приборов для технологии «реал-тайм»

Амплификаторы для технологии «реал-тайм» имеют классическую оптическую систему, состоящую из:

• Источника возбуждения;
• Системы зеркал;
• Системы линз;
• Планшета, где происходит возбуждение флуоресценции и ее эмиссия;
• Детектора.

Приборы могут различаться типами источника и детектора, но суть остается неизменной: получить результат и детектировать возникновение флуоресценции в каждой отдельной пробирке.

Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»

Программное обеспечение для этой технологии делится на две части.

Первичное – то, на котором можно видеть результаты флуоресценции, логарифмические кривые или линейные графики;

Вторичное – позволяет производить оценку, расшифровку этих данных в зависимости от цели:

• В инфектологии отображается «плюс-минус» – качественное определение инфекции;
• В случае генотипирования – это генотипирующие программы, которые позволяют разводить аллели, экспрессионные программы, программы для анализа копийности генов и так далее.

Калибровка приборов

У некоторых приборов, в частности, у Thermo Fisher Scientific, есть калибровки. Иногда производители говорят, что калибровать приборы не нужно, но это не совсем так, что отражено даже в инструкциях.

Почему это важно?

1. По району интереса

Картинка справа: чтобы прибор позиционировался правильно над лункой и происходило снятие флуоресценции из центра лунки, нужно учесть подвижность частей прибора. Снимать флуоресценцию следует из центра, а не из других точек, иначе произойдет искажение данных.

2. Калибровка по фону. Часто прибегают к различным приемам, чтобы фона не было, например, использование различного пластика по цвету. Важно убрать фоновую флуоресценцию.
3. Калибровка по чистому красителю. Важный момент: никто не предлагает калибровать по краскам, заявляя, что прибор откалиброван на заводе. Приборы действительно откалиброваны изначально под какие-то краски, но не под все. Но возникновение флуоресценции и ее гашение у разных красок происходит совершенно по-разному: некоторые умещаются в определенный спектр, а некоторые краски «фонят» и дают сигнал на другом спектре.

В связи с этим получается «подкрест каналов», когда один канал светит на другой. Этого можно избежать, откалибровав под ту краску, с которой вы работаете, прибор, который вы используете. Прибор будет «видеть» спектр вашей краски и использовать его правильно для дальнейших расчетов.

Это могут не все приборы, и это не у всех заложено в программном обеспечении. Особенно такие моменты важны для лабораторий, работающих на готовых тест-системах, а не синтезирующих себе зонды с определенными красками самостоятельно.

Например, почти у всех производителей российских тест-систем второй канал, светящийся в красках HEX, VIC, JOE – называемый желтым или зеленым – использует краску R6G. Прибор «не знает», как светится краска R6G, которая там используется – он откалиброван под другие красители. Есть вероятность, что эта краска может «зайти» на другие каналы, хотя это редкость.

На приборах QuantStudio от Thermo Fisher калибровку не стали убирать, хотя она всего лишь рекомендованная – раз в два года. Но ее стоит делать просто для того, чтобы пользователи приборов получали нормальные результаты. Доказательство пользы калибровки – успешная работа исследователей, использующих старые приборы серии 7500 и не желающие переходить на другие амплификаторы: результаты, которые они получают на своих 7500, получаются качественными, хотя в приборах используются галогеновые лампы, требующие калибровки каждые полгода(!). Кроме того, если прибор куда-либо перевезли или хотя бы переставили с места на место, целесообразно провести хотя бы калибровку по снятию данных по лункам, просто раскапав воду – это не займет много времени.

Пассивный краситель и его функция

Особенность приборов Thermo Fisher Scientific, которая присутствовала еще в одной марке оборудования, уже снятой с производства – применение пассивного красителя.

Многие производители пишут, что без него можно обойтись, так как пассивный краситель только помогает исправить неправильный оптический путь, связанный с ламповидным освещением планшета. На деле это не так.

Референсный краситель:

• Помогает сглаживать ошибки пользователя, происходящие в момент пипетирования. Они происходят, когда нужно много раз капать (и присутствует человеческий фактор);
• Сглаживает эффект от наличия пузырьков в пробирке;
• Помогает сглаживать всплеск флуоресценции, когда по каким-то причинам пробирку встряхнули и капли оказались на стенке, а потом в процессе нагревания они падают на дно, и при этом происходит всплеск флуоресценции;
• Помогает бороться с испарением – если пробирка закрыта неплотно и пойдет испарение.

На слайде отображены результаты, полученные на машине BIO-RAD, на нашем оборудовании и с референсным красителем: с красителем картинка нагляднее. Впрочем, это не обязательная опция. В качестве референсного красителя можно использовать любую краску.