История
История
Содержание статьи:
Эта публикация – первая часть вебинара «Основа основ: культивирование и криоконсервация клеточных линий в условиях санкций», состоявшегося 4 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Елена Воронцова из Новосибирска рассказала о средах и добавках для культивирования клеток, которые в настоящее время может предложить компания «Диаэм», в том числе о базальных средах и добавках, а также отдельно о средах для работы с плюрипотентными стволовыми клетками и аналогах Матригеля из Китая.
Культуральный пластик и среды необходимы в каждой лаборатории: с их использованием проводится вся рутинная работа, связанная с микробиологическим экспериментом, к каким бы направлениям он ни относился.
Недостаточно представить только продукцию партнера «Диаэм», с которым в настоящее время компания сотрудничает в области закупок культуральных сред и пластика. Стоит ознакомить слушателей и с самим этим поставщиком, вошедшим в число партнеров «Диаэм» в условиях санкций. Это компания Servicebio, которая специализируется как раз на разработке продукции и реагентов для life science (науках о жизни), причем производит не только среды и пластик, но и антитела, а также другие продукты для клеточных технологий. При этом качество всей продукции находится под строгим контролем и высоко оценено крупными научно-исследовательскими институтами по всему миру. Компания эта работает с 2007 г. и зарекомендовала себя как надежный партнер, который может поставлять качественную продукцию.
Прежде всего Servicebio – это поставщик классических базовых питательных сред любого направления. Это и DEME с высокой либо низкой концентрацией глюкозы, и DMEM/F-12, и Ham`s F-12, MEM, RPMI-1640 с различными добавками. На сайте «Диаэм» можно найти практически все среды, которые могут потребоваться для задач пользователей для культивирования клеток.
Также в списке предложений от Servicebio – буферные растворы различных модификаций: PBS, DPBS, HBSS. Которые также представлены в больших количествах на складе «Диаэм».
Компания «Диаэм» располагает самым большим складом. Основные среды и реагенты, которые часто используются для культивирования клеток, практически всегда присутствуют на складе, что позволяет осуществлять быструю доставку и поддерживать бесперебойную работу любой лаборатории.
Среди реагентов, которые производит Servicebio – растворы для диссоциации и выделения клеток, необходимые для каждого культивирования (например, буфер для лизиса эритроцитов, 0.25% трипсин с ЭДТА и без ЭДТА), а также наборы для детекции и удаления микоплазмы, причем не только методом ПЦР: есть интересный набор для определения микоплазмы методом хемилюминесценции. Кроме того, производитель предлагает реагенты для удаления микоплазмы различной степени токсичности в зависимости от ситуации и реагенты для предотвращения заражения микоплазмой, с которыми пользователь может культивировать клетки некоторое время без риска заражения и боязни, что применяемое средство будет токсично для клеток.
На складе поддерживается запас эмбриональной сыворотки. Это не Gibco, но проверенная годами сыворотка европейского качества, на нее есть все сертификаты качества, и «Диаэм» старается не допускать перебоев с поставками, поддерживая большое количество позиций на складе.
Сыворотки есть разные: помимо стандартного бычьего сывороточного альбумина (не менее 99%) и эмбриональной телячьей FBS исследовательского класса есть лошадиная сыворотка итальянского происхождения и так называемая сыворотка новорожденных телят – это вариант замены FBS, который также может быть пригоден для культивирования клеток. Но в этом случае необходимо некоторое тестирование и поиск вариантов приспособления, пользователь может получить пробный вариант, потому что эта сыворотка значительно дешевле обычной.
Культуральный пластик производят многие компании. На этом слайде представлены четыре из них: Biologix, SPL, Nest, Servicebio.
Все они поставляют пластик в полном объеме по разным позициям, в частности культуральные флаконы различного объема (рассчитанные на площади 25, 75, 175 и 225 см3) и с различным форматом крышек – глухих или с фильтром 0.22 мкм.
В ассортименте также стандартные планшеты на 6, 12, 24, 48, 96 и 384 лунки с обработанной поверхностью и с необработанной, с плоским U- и V-образным дном, что может быть полезно для культивирования 3D-культур.
Вероятно, каждый из пользователей уже попробовал какой-либо вариант пластика от новых партнеров «Диаэм», потому что замена в данной ситуации просто необходима. Если же кто-либо еще не попробовал и у него есть какие-либо пожелания, мы можем пойти навстречу и дать попробовать тот или иной вариант пластика, чтобы помочь подобрать пластик, наиболее подходящий для конкретного культивирования.(Рис-1)
Чашки Петри тоже поставляют все четыре компании с разным объемом (доступны диаметры 35, 60, 90, 100 и 150 мм) и форматом обработки – они представлены в нашем портфолио.
Большие складские запасы пластика также поддерживаются для обеспечения бесперебойной работы лабораторий клиентов «Диаэм». Поддерживается необходимое количество наиболее популярных форматов пластика.
Переходим к более интересному и специфическому классу продукции. Помимо базовых сред и пластика, используемых в рутинном культивировании, у «Диаэм» есть уникальные среды и реагенты, замена которых наверняка для многих стала очень серьезным вопросом.
Компания «Диаэм» нашла нового партнера – компанию Nuwacell, которая производит среды для работы с плюрипотентными стволовыми клетками человека.
Компания основана доктором Джуньинг Ю – ученым мирового уровня, которая участвовала в создании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Она уже успела завоевать большой уровень внимания и достичь высокого уровня разработки продукции для всей цепочки производства стволовых клеток, включая создание банков стволовых клеток, наборов для дифференцировки иПСК в различные функциональные клетки и разработки препаратов на основе стволовых клеток для лечения различных заболеваний и решения различных других задач.
Напомним: плюрипотентные стволовые клетки – это клетки, которые подверглись репрограммированию, то есть из дифференцированных клеток получают недифференцированные, так называемые плюрипотентные стволовые клетки, которые потом можно дифференцировать в разные органы и ткани и работать с этими клеточными моделями для разных задач, среди которых самая популярная – это скрининг лекарственных препаратов и оценка их безопасности.
Кроме того, возможны различные эксперименты по трансплантации клеток на моделях животных, а в перспективе это выход на лечение плюрипотентными стволовыми клетками различных заболеваний у человека. Но пока все это у нас в разработке.
Итак, что может предложить компания в сложившейся ситуации на замену уже известным европейским брендам, работавшим с этой проблематикой и разрабатывавшим сложные среды? А нужно сказать, что эти среды действительно очень сложные, их долго разрабатывать, они многокомпонентные, но тем не менее китайская компания, которую мы здесь представляем, имеет очень хороший набор сред и реагентов для работы со стволовыми клетками.
На этом слайде представлены две среды, между которыми есть некоторые различия – RP01020 ncTarget hPSC Medium и RP01001 ncEpic hPSC Medium.
Сотрудники «Диаэм» сами еще в процессе осознания этих различий и потому рассчитываем получить обратную связь от тех, кто готов пользоваться этими средами. Обе они бессывороточные, бесфидерные, могут обеспечивать длительное поддержание плюрипотентных стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Также такая среда подходит для эмбриональных стволовых клеток, она многокомпонентная – здесь есть сама среда и специфические добавки, которые нужно один раз добавить, после чего в течение месяца можно работать с этой средой.
Представляют интерес и необычные наборы, которых прежде невозможно было найти на европейском рынке среди продукции привычных производителей известных ранее брендов.(Рис-2)
Первый и, вероятно, самый удивительный – набор для дифференцировки иПСК в нефроны hPSC-Nephron Differentiation Kit (RP01015).
Очень интересный момент состоит в том, что если процесс проводится в 2D-культуре, то формируются почечные клетки, а при 3D-культивировании уже могут формироваться почечные органоиды, нефроны как структурно-функциональные единицы почки.
Что из себя представляют эти наборы и как они вообще представлены, можно увидеть на слайде. На первый взгляд, это очень сложная схема-таблица, но на самом деле все просто. Есть разные добавки в среды: A, B, C, D, E, и с первого дня дифференцировки пользователь просто по порядку начинает добавлять эти компоненты сред – и соответственно количеству дней в этой среде проводится культивация.
Для этого набора дано хорошее схематическое представление процесса, который при его использовании происходит, и из схемы понятно, сколько дней в какой среде нужно проводить культивацию.
Этот пример показывает, что информационное или методическое сопровождение тоже присутствует, причем на очень качественном и доступном уровне.
На следующем слайде представлены маркёры, доказывающие, что действительно прошла дифференцировка, причем на последней картинке показаны даже органоиды, которые формируют нефроны-клетки. Собственно, все маркеры, которые соответствуют этому виду дифференцированной ткани, убедительно представлены на данной картинке.
Следующий набор, который может быть широко востребован – для дифференцировки иПСК в клетки пигментного эпителия сетчатки hPSC-RPE Differentiation Kit (RP01016).
Еще один набор позволяет дифференцировать иПСК в дофаминэргические нейроны hPSC-Dopaminergic Neuron Differentiation Kit (RP01017) – пожалуй, это единственный набор, который есть и у других брендов.
Также есть набор для дифференцировки иПСК в моторные нейроны hPSC-Motor Neuron Differentiation Kit (RP01018).
МСК также культивируются в бессывороточной среде, которая не содержит компонентов животного происхождения. В такой среде можно длительно культивировать клетки при сохранении соответствующих поверхностных маркеров для мезенхимальных стволовых клеток, которые здесь перечислены: CD73+ / CD90+ / CD105+, CD14- / CD34- / CD45- / CD79a- / HLA-DR-.
Конечно, чтобы работать с МСК человека, необходимы другие компоненты – прежде всего специальная среда для заморозки, и для того, чтобы оценить, насколько они являются МСК – это наборы для остеогенной дифференцировки RP02014-C и адипогенной дифференцировки RP02014-A.
Среда для заморозки имеется не только для МСК, но и для индуцированных ПСК человека: это тоже актуальная часть работы с иПСК.
Так что в портфеле «Диаэм» присутствует весь набор средств для работы со стволовыми клетками.
Вероятно, это очень убедительная компания, которая не просто производит наборы, но и сама активно работает в этом направлении, создавая уже конечные клеточные продукты.(Рис-3)
Отрадно также сообщить, что очень популярная в работе с клетками добавка ncB27 для культивирования нейрональных культур также производится в этой компании в двух вариантах – с витамином А и без витамина А (рекомендуется для краткосрочного или долгосрочного культивирования и поддержания гиппокампа и других нейронов центральной нервной системы).
Эту добавку «Диаэм» может поставлять без проблем – не окольными путями, а непосредственно от производителя, и это очень хорошая новость.
Немного о ситуации с красителями, которые сейчас в связи с санкциями завозить невозможно. На данном этапе все, что может предоставить «Диаэм» от своих партнеров – это продукция двух компаний: Servicebio и Vazyme, у которой тоже имеется небольшой список красителей.
Красители указанных фирм включают три раздела: окрашивание внутриклеточных структур, наборы для определения апоптоза и наборы для оценки клеточной пролиферации. Это три основных набора красителей, которые наиболее востребованы для большинства работ с клетками.
«Диаэм» может предложить стандартные красители – например, весь их список, используемый в рутинной культуральной работе для оценки внутриклеточных структур. Например, среди продукции Servicebio есть такие красители как Хёхст, ДАПИ, пропидий йодид, фаллоидин с различными вариантами окраски, а также красители для оценки мембранного потенциала митохондрий и стандартный краситель DiO для оценки клеточной мембраны.
И здесь, к нашей большой радости, «Диаэм» удалось найти такой завоевавший популярность продукт, как Click-iT eDU с различным количеством окрасок – 3 или 5 разных вариантов окраски eDU, можно выбрать любой вариант окраски, который необходим пользователю в конкретном эксперименте.(Рис-4)
Также есть в наличии классический набор для определения жизнеспособности – это Calcein AM.
И собственно, сама «суперклассика» – набор для анализа пролиферации клеток MTT, который присутствует в нескольких вариантах, и не только для пролиферации клеток MTT, но и его различные аналоги: есть возможность выбрать.(Рис-5)
Классический набор для определения апоптоза – это TUNEL. Он есть у обеих компаний: например, Vazyme создал свой интересный набор с усилителем окраски, чтобы окраска была более яркой и презентабельной: это его запатентованное новшество.
Классический вариант наборов для определения апоптоза Annexin присутствует во многих вариантах с различным типом окрашивания, любой – зеленый, красный и т.д. В данном случае можно тоже выбрать не только различные варианты, но и разных производителей, различные комбинации. Например, классический набор для оценки апоптоза и клеточного цикла одновременно с пропидий йодидом.
Помимо таких рутинных наборов можно привезти и более специфические, менее популярные наборы для разных вариантов: они тоже существуют, хотя, возможно, не так широко представлены. Тем не менее, наборы, которые потребуются пользователю для окрашивания каких-либо определенных структур, «Диаэм» может привезти по запросу.
Все наборы для работы с иПСК по мере возможностей выставляются на сайте компании, но ассортимент меняется быстро, так что не всегда удается сразу же разместить на сайте всю информацию об обновлениях ассортимента. Поэтому пользователям рекомендуется обращаться в «Диаэм» с конкретными запросами: если что-то заинтересовало, на нужный продукт будут предоставлены все цены и описания. Это же касается и других вопросов, в частности возможностей использования пластика – например, того, какой пластик вы хотели бы заменить, какие индивидуальные запросы у вас есть. Компания готова пойти навстречу пользователям и предложить варианты.
Все интересующие вопросы можно задать Елене Воронцовой по телефону
+7-985-154-74-10
Или электронной почте evorontsova@dia-m.ru
Новость о вебинаре «Основа основ: культивирование и криоконсервация клеточных линий в условиях санкций»
Ссылки на остальные части вебинара:
Криоконсервация и криохранение (транскрибация видеозаписи вебинара лектория Диаэм сезона 2022)
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
