История
История
Содержание статьи:
Эта публикация – вторая часть вебинара «Основа основ: культивирование и криоконсервация клеточных линий в условиях санкций», состоявшегося 4 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Руководитель отдела развития региональных продаж «Диаэм» Юлия Тялина рассказала об устройствах для замораживания как важнейшего этапа подготовки образцов для хранения при температуре жидкого азота – программных замораживателях и штативах для заморозки, а также о системах криохранения Haier емкостью от 10 л до 1880 л, удовлетворяющих потребности как небольших лабораторий, так и масштабных биотехнологических производств.
После культивирования и последующей необходимой трансформации клетки важно сохранить, а для этого их в первую очередь нужно грамотно заморозить. Очень быстрое или, напротив, очень медленое замораживание приводят либо к обезвоживанию, либо к образованию кристаллов льда, вследствие чего повреждаются различные белки. А значит, необходимо специализированное оборудование, в котором замораживание происходит с правильной скоростью – программируемый замораживатель.
Ранее «Диаэм» предлагал к поставке различное криогенное оборудование известных производителей, таких как Thermo FS, а также Cryopal или MVE. В настоящий момент в силу известных причин это невозможно, но доступно оборудование китайского производителя Haier, и оно не только не хуже продукции европейских производителей, но и в некоторых случаях превосходит их по характеристикам.
Программируемый замораживатель осуществляет замораживание клеток при определенной температуре. Например, образцы, имеющие температуру +20 ºС, медленно охлаждаются: пользователь задает программу, в соответствии с которой при +4 образец выдерживается 10 минут, затем при нуле – например, 15 минут, и так постепенно температуру снижают до -150 ºС, после чего можно спокойно перенести образец в криохранилище, где он будет храниться в жидком азоте.
Осуществляется это программируемое замораживание по заданной программе посредством впрыскивания жидкого азота в камеру, где расположены образцы. Подача азота осуществляется из сосуда Дьюара, расположенного рядом с программируемым замораживателем. Объемы, которые можно замораживать таким образом, находятся в диапазоне от 0,2 мл до трансфузионных мешков объемом 700 мл.
Главное требование к образцу: слой замораживаемого образца должен быть достаточно тонкий. Невозможно поставить флакон емкостью 250 мл и заморозить его содержимое правильно, потому что в соответствии с законами физики верхние слои жидкости уже будут заморожены, в то время как внутри еще будет оставаться жидкость. Жизнеспособность клеток после замораживания в подобных плохо контролируемых условиях замораживания окажется очень низкой.
В настоящее время «Диаэм» предлагает программируемый замораживатель Haier CJ-L37 с объемом рабочей камеры 37 л. Ранее Thermo FS предлагал аналогичное оборудование CryoMed от 17 до 48 л, но наибольшей популярностью пользовался средний объем. По этой причине китайский производитель и сконцентрировал внимание на производстве модели среднего объема (37 л).
Программируемый замораживатель Haier имеет сенсорный дисплей, на котором отображается температура в рабочей камере и образца, этапы замораживани. Прибор имеет USB порт, который позволяет перенести отчет о работе в формате *.pdf на компьютер и там его хранить, а при необходимости просматривать, чтобы планировать дальнейшие процессы. Через этот же порт можно подключить баркод-ридер (сканер штрих-кодов), если в лаборатории идет работа с большим количеством. Программны замораживателья европейских производителей не обладали подобной возможностью.
Следует отметить, что этот прибор достаточно дорогой и предназначен для большого количества проб. Если же в небольшой лаборатории есть необходимость заморозить всего несколько образцов, «Диаэм» предлагает криоштативы для замораживания 12 проб.
Ранее компания Thermo FS предлагала подобный штатив под названием Mister Frosty, но он был достаточно неудобен в работе. Необходимо было заполнить этот контейнер изопропанолом, охладить его в морозильнике, осуществляя предварительное охлаждение (прекулинг), и только после этого уже размещать в нем образцы.
Китайская компания Nest производит пластиковые штативы (номера в каталоге 200102, 200101), которые не нужно предварительно замораживать. Пользователь просто помещает свои пробы в штатив и убирает его в низкотемпературный морозильник. За 4 часа хранения в кельвинаторе (низкотемпературном холодильнике) температура образцов понижается до -80 ºС. Происходит медленное замораживание со скоростью приблизительно 1 ºС/мин. Подобная скорость замораживания сохраняет высокую жизнеспособность клеток.
Сейчас на складе «Диаэм» есть такие штативы, и их запасы регулярно пополняются. Для любой лаборатории будет очень полезно иметь такие криоштативы, поскольку они позволят грамотно замораживать клетки в безопасном для них режиме.
После заморозки образцов нужно обеспечить хранение. Во многих лабораториях необходимы криохранилища для небольшого количества проб. Криопробирки или криосоломины хранят в вертикальных держателях – тростинах. Криопробирки размещают в тростине – полом держателе; в одной тростине помещается от 5 до 6 криопробирок объемом от 1,5 до 2 мл. Потом эту тростину ставят, как палочку, в канистру (цилиндр с длинной ручкой), канистру размещают в криохранилище.
Ранее ООО «Диаэм» предлагало криохранилища BioCane от Thermo FS – четыре модели емкостью от 20 л до 70 л. Китайский производитель предлагает 24 криохранилища серии YDS – от 2 л до 50 л. Это позволяет подобрать криохранилище под любые потребности лаборатории.
Диаметр горловины в таких устройствах варьируется от самого узкого до достаточно широкого (30-127 мм у Haier против 50-150 мм у Thermo FS). Следует отметить, чем уже диаметр горловины, тем меньше скорость испарения азота – и тем дольше можно хранить образцы без добавления жидкого азота. Пользователю необходимо периодически пополнять криохранилище жидким азотом. Дозаправку осуществляют на основании измерения уровня жидкого азота в рабочей камере. Haier предлагает аксессуар под названием Smart Cap, который позволяет в режиме реального времени проводить мониторинг уровня азота и температуры внутри рабочей камеры, что позволяет запланировать своевременное пополнение криохранилища жидким азотом.
В ближайшее время этот же аксессуар позволит отправлять эти параметры в облачный сервер Haier Эта опция уже указана в проспектах производителя, она заработает в ближайшее время.
Большое количество образцов, как правило, хранят не в вертикальных держателях – тростинах, а в криокоробках.
Компания Thermo FS предлагала всего одно криохранилище с криокоробками для хранения 25 пробирок. Haier в настоящее время предлагает пять моделей объемом от 10 до 50 л. По опыту известно: большинство пользователей не очень любят размещать в тростинах даже небольшое количество проб, предпочитают работать с криокоробками.
И именно эти модели – серии Small sized YDS – как раз удовлетворят потребности, потому что даже 10-литровое криохранилище укомплектовано держателем для 4 криокоробок на 25 мл. Это значит, что если пользователь открыл криохранилище, достал одну криокоробку на 25 пробирок, то температурное воздействие испытали не 100 пробирок, как обычно, в классической криокоробке, а всего 25 пробирок.
Эти модели, как мы считаем, будут наиболее востребованы, и со временем будет сформирована складская программа в зависимости от актуальных потребностей пользователей.
Также у Haier есть очень интересное криохранилище (YDS-47-127), которое позволяет хранить пробирки не в стандартных криокоробках на 25 пробирок, а в круглых криокоробках (37 криопробирок 1,5/2,0 мл), размещаемых в специализированном штативе.
Опционально в таких устройствах тоже возможен мониторинг температуры и в ближайшее рвемя заработает сервер хранения данных, упомянутый выше.
Если в лаборатории имеется большее количество проб, можно предложить криохранилища Smart или Medium, которые позволяют осуществлять криохранение в коробках на 81 или 100 пробирок. Это классические криокоробки, с которыми работают большинство пользователей.
Нужно отметить, что криохранилища серии Medium позволяют также хранить трансфузионные пакеты. Ни у одного европейского производителя не было такой опции! Если у пользователя была потребность хранить трансфузионные или культуральные пакеты, ему нужно было бы покупать большое криохранилище специально для этих целей. В настоящий момент можно хранить пакеты в криохранилище объемом всего 65 л.
Криохранилище серии Smart имеет дисплей (изображен на рисунке), который постоянно отображает температуру в рабочей камере и уровень заполнения жидким азотом. Серия Medium sized попроще: она не имеет такого дисплея, но ее можно укомплектовать устройство мониторинга ZTC-100A, который постоянно будет измерять температуру и при необходимости подавать сигнал низкого уровня жидкого азота в рабочей камере. Опять-таки в ближайшее время для всех криохранилищ Haier будет доступно подключение к облачному серверу, на который будут отправляться данные со всех криохранилищ – от маленького до «монстроидного» объемом более 1000 л.
Для биотехнологических производств можно предложить криохранилища Biobank Series серии YDD от 350 до почти 2000 л.
Они позволяют осуществлять хранение от 13 тысяч до 95 тысяч 2мл-пробирок при размещении пробирок в криокоробках на 81 пробирку. Также возможно хранение трансфузионных пакетов или пробирок на 5 мл. Хранение образцов осуществляется как среде жидкого азота, так и в парах азота.
Прежде всего тем, что оно имеет узкую горловину и карусель (вращающуюся платформу в рабочей камере) для размещения штативов с образцами. Для получения доступа к необходимому штативу достаточно повернуть карусель, что обеспечивает возможность достать штатив из криохранилища через узкую горловину.
Все управление осуществляется через сенсорный дисплей, который представлен на слайде. Нажатием на одну пиктограмму можно включить процесс быстрого удаления паров при открытии крышки. Обычно, когда крышку криохранилища открывают, азот начинает парить, отчего все содержимое не очень хорошо видно, так как сразу происходит оседание льда на поверхности. Если включить «дефрогинг», образование тумана не происходит.
Инновационная конструкция этого криохранилища позволяет даже в отсутствие дозаправки азотом в течение 20 дней сохранять температуру -135 ºС, что вполне достаточно для сохранения жизнеспособности образцов.
На линии заполнения жидким азотом стоит байпас, который обеспечивает дополнительное охлаждение поступающего жидкого азота, чтобы избежать нагревание азота в рабочей камере.
Для питания этих криохранилищ необходимо устанавливать рядом с ними сосуд Дьюара под давлением или использовать централизованную систему обеспечения жидким азотом. Конечно, создание такой системы – это уже достаточно сложное инженерное решение, поэтому в основном используют сосуды Дьюара для автоматической дозаправки.
Haier предлагает сосуды Дьюара YDZ / YDZ-K, объемом от 5 л до 500 л (24 модели). Европейские производители (Thermo FS, Cryopal) предлагали всего 7 моделей (максимальный объем 230-280 л). При осуществлении автоматической дозаправки криохранилищ большого объема (более 400 л) приходилось достаточно часто менять эти сосуды. 500-литровый сосуд Дьюара обеспечивает более длительный процесс поддержания необходимой температуры в рабочей камере.
Если же учесть показатели по скорости испарения азота, приведенные на слайде в последней строке, то видно, что за счет более продвинутой инженерной конструкции криохранилище Haier имеет меньшую скорость испарения азота.
Если у Thermo FS сосуд Дьюара испарял 4.6 л в день, то у Haier этот показатель почти вдвое меньше. Это значит, что такого сосуда Дьюара хватит на большее время.
Все сосуды Haier вне зависимости от объема сконструированы так, чтобы хранить азот под давлением. Если у европейских производителей такую опцию имели только сосуды от 50 л, то все сосуды Дьюара производства Haier работают под давлением, что также обеспечивает экономию жидкого азота.
Как правило, сосуды Дьюара под давлением оборудованы манометром. Необходимо контролировать показания манометра, чтобы определить количество азота в резервуаре: если давление уменьшается, то, значит, количество азота в резервуаре уменьшилось.
Сосуды Дьюара Haier YDZ-K имеют дисплей, который представлен на слайде. Он постоянно отображает уровень жидкого азота в криохранилище.
Также в лабораториях используются «драйшипперы», которые нужны для переноса образцов при температуре жидкого азота, например из одной лаборатории в другую. Конечно, ездить по городу или даже перемещаться внутри одного института с сосудом, в котором плещется жидкий азот – это тяжело и малоприятно.
Поэтому давно разработано оборудование, которое внутри имеет специальный материал, впитывающий внутри рабочей камеры жидкий азот. Этот азот постоянно испаряется в пространство рабочей камеры, в результате чего образцы хранятся при температуре жидкого азота, но при этом пользователь избавлен от всех неудобств, связанных с переносом образцов в жидкой фракции. Такое оборудование Haier представлено пятью моделями емкостью от 3 до 25 л.
При этом пользователь может хранить пробирки как в тростинах, так и в криокоробках на 25 и 100 штук, что очень удобно для работы.
Нужно отметить, что преимущественно образцы хранят в криохранилищах в жидком азоте, и это приводит к некоторым неудобствам, а именно возможности контаминации. Если же хранить образцы в парах азота, а не в жидкой фазе, это позволяет избежать контаминации.
Как правило хранение в парах азота реализовано в больших хранилищах, предназначенных для биотехнологических производств. Если же это требуется в объеме 20-50 литров, достаточно пне размещать криокоробки в нижнем ярусе штативов: в криохранилище просто наливается азот, и все образцы хранятся на ярусах, за исключением нижнего, в парах этого азота. Такую рекомендацию не найти в проспектах на оборудование от производителя, но в личном общении его представители говорят, что это совершенно нормально и температура в верхней части криохранилища в этом случае достаточно низкая.
Следует отметить, что для хранения при подобной низкой температуре можно использовать криогенные морозильники, и в данном случае это тоже оборудование Haier. Если ранее использовались такие морозильники производителя PHCBi (Panasonic / Sanyo), то теперь есть подобное оборудование Haier, которое, в отличие от криохранилищ, обеспечивает большую гомогенность температуры по всей высоте рабочей камеры. Законы физики никто не отменял: мы понимаем, что если жидкий азот находится внизу, то в верхней части камеры температура будет несколько выше, чем в нижней.
При необходимости меньшего градиента температуры по высоте рабочей камеры лучше использовать криогенные морозильники. «Диаэм» предлагает морозильник объемом более 200 литров, в котором разница между температурой в нижней и верхней точке не превышает 10оС, а диапазон поддерживаемой температуры - -130/-150 оС.
У криогенного морозильника Haier DW-150W209 емкостью 209 л также есть USB порт, который позволяет перенести протокол хранения в *.pdf формате на компьютер. Этот морозильник можно даже установить в лаборатории, потому что он обладает низким уровнем шума (55 дБ), что вообще-то для холодильного оборудования такого температурного диапазона достаточно редко встречается. В этом морозильнике с двумя внутренними дверями можно размещать различные штативы с образцми: пробирки обхемом 2 мл, 5 мл, соломины, трансфузионные мешки.
Дополнительную информацию по всем типам оборудования для криоконсервации и криохранения можно получить, написав Юлии Тялиной на электронную почту jtyalina@dia-m.ru или позвонив по телефонам +7-495-745-0508, доб. 148, или +7-926-246-87-54.
Новость о вебинаре «Основа основ: культивирование и криоконсервация клеточных линий в условиях санкций»
Ссылки на остальные части вебинара:
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
