История
История
Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание первой части вебинара «Клеточная биология в формате Single Cell», состоявшегося 11 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Татьяна Сульгина («Диаэм» - Новосибирск) рассказала о стандартизации пробоподготовки в цитологии, использовании клеточных диссоциаторов, магнитных сепараторов и счетчиков клеток от компании RWD для выделения клеток из образцов тканей и дальнейших действий с ними.
RWD Life Science (Китай) – производитель широкого спектра лабораторного оборудования для клеточной и молекулярной биологии, гистологии и ветеринарного оборудования для работы с лабораторными животными, существующий на рынке более 20 лет.
Для обеспечения точности, безопасности и надежности продукции, а также клиентоориентированности в RWD внедрены строгие стандарты контроля, управления и учета на каждом этапе высокотехнологичного производства.
Поэтому продукция RWD завоевала признание в более чем 100 странах мира, используются в более чем тысячах университетов, научно-исследовательских институтов и ветеринарных клиник и сотнях больниц.
Пробоподготовка в микробиологии происходит так: фрагмент ткани, полученный прижизненной биопсией или после смерти, измельчают механически, обрабатывают протеолитическими ферментами, расщепляющими внеклеточный матрикс: трипсином, коллагеназой, папаином или их комбинациями. В дополнение к ферментам используют кальций-связывающие соединения – хелаторы, которые забирают кальций у молекул клеточной адгезии и ослабляют связи их между собой и с внеклеточным матриксом. Добавление ДНКазы позволяет предотвратить склеивание клеток в текучие сгустки за счет электростатических взаимодействий.
После этого клетки отделяют от остатков матрикса центрифугированием или фильтрацией и высаживают на флаконы или чашки Петри.
Области применения первичных культур клеток
Традиционные сферы применения первичных клеточных культур – это:
- Иммунологические исследования;
- Исследования в области онкологии;
- Исследования иПСК (индуцированных плюрипотентных стволовых клеток);
- Нейронауки;
- Клеточная терапия.
Классические инструменты для измельчения образца – это, конечно, ступка и пестик.
Их преимущества – в доступности и простоте использования, а также минимальной потребности в техобслуживании. Но налицо и недостатки: низкая пропускная способность, возможность ошибки оператора и плохая воспроизводимость результатов.
Также применяется ротор-статор.
Его преимущества: быстрота и эффективность для отдельных образцов, модельный ряд под различные объемы – доступны модели как для лабораторий, так и для пилотных и промышленных производств. Но есть и минусы: иногда низкая пропускная способность; зонды необходимо промывать перед использованием, возможна перекрестная контаминация. Такой метод подходит для твердых и волокнистых образцов, но для них необходима еще и предварительная обработка, что является недостатком.
Гомогенизаторы также решают упомянутую задачу.
Всем известный FastPrep – универсальная система, подходящая для образцов любой твердости, в том числе, что важно отметить – для твердых и волокнистых образцов, которым в этом случае не нужна предварительная обработка. Это устройство простое в использовании и, что важно в новой реальности, возможны быстрые поставки. Но остается минус: каналы гомогенизатора необходимо промывать, и возможна перекрестная контаминация.
И есть диссоциатор клеточный, или диссикатор
Его преимущества в том, что такая система универсальна, имеет большое количество каналов (4 или 8), которые можно запустить одновременно. Прибор прост в использовании, имеет дружественное для пользователя программное обеспечение, совмещает в себе механическую и ферментативную гомогенизацию. Возможен подогрев образцов, диссоциатор имеет валидированный протокол.
Но опять же: если используются многоразовые пробирки, никто не застрахован от перекрестной контаминации.
Что касается пробирок для такого гомогенизатора, они имеют пластиковые режущие (перетирающие) элементы из пластика. При одноразовом использовании они стерильны, но эта их одноразовость и представляет недостаток.
Сейчас предлагаются две модели диссоциаторов от RWD: DSC-400 и DSC-800.
У RWD эти наборы разделены по объектам исследования: мышь или крыса. Есть также разделение по сфере того, что нужно расщеплять: можно обработать этими наборами опухолевую ткань (мыши), ткань мозга (мыши или крысы) или ткань селезенки (мыши). Подробнее об этих наборах можно узнать на нашем сайте, воспользовавшись QR кодом со слайда.
Особенности этих наборов в том, что они сохраняют высокую жизнеспособность клеток, не влияют на поверхностные рецепторы. При помощи одного набора можно провести 50 выделений.
Порядок цен отображен на слайде (на момент подготовки доклада – от 31200 до 67950 рублей).
После очистки клетки нужно отделить. RWD предлагает для этих целей наборы для магнитной сепарации. Они тоже разделяются по объекту исследования и по типу сепарируемых клеток.
Объекты – либо человек либо мышь – соответственно, можно работать с определенными тканями человека или мыши.
По типу клеток: CD3+, CD4+, CD8+.
Порядок цен также отображен на слайде: от 8100 до 10500 рублей, эти наборы достаточно бюджетные.
Можно сказать, что магнитные сепараторы обеспечивают эффективную сепарацию без сортера.
Среди преимуществ этих сепараторов:
- короткое время протокола – от 60 до 90 минут,
- выгодное соотношение цены и качества,
- многообразие наборов для сепарации, которые также представлены у нас на сайте,
- высокая чистота и жизнеспособность полученных клеток,
- полученные клетки можно использовать для дальнейших приложений.
- (и это важно!) прибор не требует использования электричества.
При помощи магнитных сепараторов можно добиться отличных результатов: чистота образцов клеток получается достаточно высокая по сравнению с другими магнитными сепараторами и наборами для магнитной сепарации.
Отметим, что у наборов для магнитной сепарации пока что расчета, на сколько выделений их хватает: указана только емкость клеток в колонке, а именно 7 *109 клеток, то есть 7 млрд. Набор содержит 2 колонки.
Результаты использования сепараторов
На слайде представлены результаты выделения клеточных культур пользователями. На диаграммах А и В представлено сравнение чистоты образцов клеток селезенки мыши до и после выделения CD3 и CD4. На диаграммах C и D отображена скорость восстановления и жизнеспособность образцов клеток селезенки мыши после выделения CD3 перед сортировкой, с использованием магнитного сепаратора RWD и другого оборудования.
Результаты подтверждают, что после магнитной сепарации на наборах RWD наблюдаются высокие скорость восстановления и жизнеспособность клеток, что также представлено на слайде.
Итак, совокупностью диссоциатора, набора для ферментативного выделения, магнитного сепаратора и наборов к нему можно получить стандартизованную подготовленную первичную культуру клеток с высокой жизнеспособностью.
После получения образца клеток необходимо произвести их подсчет. Ранее это делали при помощи камеры Горяева, что занимало немало времени, требовало определенной трудоспособности оператора и в известной мере зависело от его особенностей.
Теперь есть счетчики клеток, использование которых требует гораздо меньше времени, к тому же исключает ошибки операторов и позволяет не только подсчитать, но и идентифицировать живые и мертвые клетки.
Модельный ряд счетчиков клеток у RWD представлен тремя моделями: C100 (анализ флуоресценции клеток + кубы), C100-SE (анализ флуоресценции и биолюминесценции клеток) и C100-PRO (самый быстрый и точный прибор из представленной линейки, соответствующий требованиям мировой фармакопеи). Их характеристики представлены на слайде, а с подробным описанием можно ознакомиться на сайте «Диаэм».
В чем преимущества этих устройств: у них есть алгоритм распознавания кластеризованных клеток, в чем мы видим сходство с классическими Luna или Countess, которые давно известны пользователям.
Также есть калькулятор предварительного разбавления и возможность кастомизации протокола. Это значит, что можно отобрать клетки по их округлости, их размеру и цвету.
Где можно применить эти возможности приборов?
- Для подсчета жизнеспособности клеток,
- Для оценки эффективности трансфекции,
- Для анализа жизнеспособности флуоресцентными красителями.
Итак, использование продукции RWD для пробоподготовки в цитологии можно описать тремя словами: точность, скорость, простота.
Эта продукция уже опробована пользователями, а данные с использованием техники RWD для пробоподготовки в цитологии уже можно встретить во многих публикациях.
Вопросы по продукции RWD для цитологической пробоподготовки можно задать по телефону +7 (913) 8228845 или электронной почте tsulgina@dia-m.ru.
Новость о вебинаре «Клеточная биология в формате Single Cell»
Ссылки на другие части вебинара:
Клеточная биология в формате Single Cell. Современные подходы в работе с 3D-культурами клеток
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
