История
История
Содержание статьи:
Продолжаем цикл статей о классических и экспресс-методах детекции патогенов в пище и окружающей среде. Ссылка на 1 часть здесь.
Со средами Thermo FS можно получить достоверные результаты, в которых пользователь может быть уверенным, проводить тестирование в соответствии с государственными стандартами. С продукцией компании не только можно достичь результата быстрее и проще за счет использования предлагаемых экспресс-методик, но и внедрить новейшие технологии – ПЦР, NGS – в лабораторную практику.
Методика ПЦР достаточно важна в современных лабораториях. Она открывает новые диапазоны для исследований: ПЦР детектирует определенные ДНК микроорганизмов, соответственно объем информации, получаемый после исследования, достаточно большой, и в целом использование систем ПЦР существенно расширяет возможности лаборатории.
Предложение Thermo FS по использованию ПЦР для детекции патогенов в пище – это наборы SureTect.
Эти наборы производятся на многие патогены: сальмонеллу, Listeria monocytogenes, Campylobacter, e. coli, стафилококки, Cronobacter, e. coli O157H7, три вида вибрионов. Линейка наборов SureTect пополняется почти ежегодно: добавляются новые реагенты, так как требования в мире расширяются, появляются новые стандарты, и методика ПЦР все больше входит в практику организации исследований пищи на патогены. Так что и в будущем линейка этой продукции совершенно точно будет пополняться новыми патогенами.
Удобство набора SureTect в том, что он содержит все необходимое для постановки реакции, причем реагенты уже разлиты в пробирки: требуется минимум манипуляций, чтобы поставить ПЦР.
В голубых пробирках для лизиса уже находятся реагенты. После предобогащения туда добавляется образец, а также фермент Протеиназа К – он поставляется отдельно, чтобы не нарушить его стабильность.
Если исследуются листерии, имеющие плотную бактериальную стенку, еще потребуется реагент для лизиса 2, чтобы ее разрушить.
После добавления образца в пробирку для лизиса ее ставят в амплификатор SimpliAmp, чтобы провести этап лизиса.
Далее проба из этих пробирок отбирается и добавляется в пробирки для ПЦР – они поставляются в пакете из фольги, и в них в сухом виде уже есть вся реагентика для постановки ПЦР. Все, что нужно – это перенести образец из пробирок для лизиса в ПЦР пробирки, закрыть специальными крышками, которые тоже поставляются в наборе, и поставить в оборудование для ПЦР. Все быстро и просто – минимум манипуляций, а значит, меньше и возможность ошибки.
Протокол достаточно упрощенный: обогащение, лизис, ПЦР и затем подтверждение.
Важный момент: при такой технологии используется один протокол термоциклирования для всех патогенных мишеней. А значит, за один ПЦР можно поставить пробы на листерию, сальмонеллу, e.coli, можно тестировать на несколько патогенов за один запуск ПЦР. Протоколы термоциклирования для всех наборов SureTect оптимизированы.
После ПЦР нужно подтверждение для каждого альтернативного метода. Делать подтверждение предлагается, например, на среде Brilliance: нужно взять аликвотированную пробу после обогащения, высеять на среду Brilliance, после инкубации проверить, есть ли необходимые колонии – и подтвердить на латексном тесте. В целом ПЦР метод намного быстрее: результаты получаются примерно на 3-6 дней быстрее, чем классическим методом.
Иллюстрация показывает сравнение альтернативных методов и детекции классическим методом по сальмонелле.
Классический метод по ISO 6579 требует от 4 до 5 дней и больше в зависимости от того, какое подтверждение выбирает пользователь (так как может потребоваться пересев на неселективный агар). С альтернативным методом ПЦР и использованием SureTect Salmonella сначала на предобогащение тратится от 8 до 24 часов в зависимости от типа образца, потом ПЦР протекает 2 часа, а далее проводится подтверждение – до получения отрицательного результата – от 16 до 26 часов. Такая существенная экономия времени может означать и экономию в средствах, поскольку для производителей пищевых продуктов ожидание результатов тестирования партии означает затраты на оплату склада и холодильников до выпуска партии продукции на прилавки. И эти затраты можно снизить, если быстрее провести тестирование, получить результаты и выпустить готовую продукцию на прилавки.
Так что внедрение новейших технологий, в частности ПЦР, существенно ускоряет проведение иссдедований и расширяет возможности лабораторий. ПЦР может детектировать и бактерии, и вирусы, и многие другие организмы, то есть это достаточно глобальная технология. Она существенно упрощает и совершенствует используемые в лаборатории методы.
Еще дальше шагнуть позволяет использование технологий секвенирования.
Thermo FS предлагает решение для NGS в виде наборов SGS All Species ID.
Это специальные реагенты и оборудование для секвенирования, которые используются для выявления фальсификации продуктов. Итак, проверка пищевых продуктов на подлинность осуществляется методом NGS.
Например, если исследуется продукция, где должны присутствовать только ДНК животных, то есть мясо определенного вида или мясные продукты, консервы, то результаты, показывающие наличие там ДНК растений, свидетельствуют о фальсификации. Методика позволяет выявить все виды животных, растений или рыб, которые есть в образце пищи, и таким образом выявить подлинность продукта.
Это весьма актуальная задача, поскольку фальсификация пищевых продуктов – довольно острая проблема на сегодня во всем мире. Фальсифицируют мясные, рыбные продукты, копчености, консервы, молочную продукцию: проверка может выявить, что в якобы натуральном молоке коровьей ДНК нет вообще, зато есть ДНК сои или чего-то еще, и это происходит довольно часто.
Процесс выявления фальсификата с использованием технологии NGS выглядит так: берется всего 200 мг образца, проводится протокол исследования, в результате получается список всех видов животных, рыб и растений, которые содержатся в образце.
Постадийно: сначала берется 200 мг пищевого образца, затем идет подготовка ДНК, выделение ДНК, используются специальные приборы для подсчета ДНК, идет этап подготовки библиотек, проводится амплификация с использованием специальных наборов SGS All Species ID.
После этого пользователь на флеш-носителе забирает из секвенатора файл данных – файл сиквенса – и открывает в программе для анализа данных – SGS All Species ID или Torrent Suite. Программное обеспечение проводит анализ данных – сравнивает данные полученного сиквенса с базой данных, содержащей информацию о последовательностях для десятков тысяч видов животных, растений и рыб.
Программа выдает отчет в виде списка-таблицы с процентным содержанием того или иного вида в данном продукте.
У программного обеспечения есть возможность демо-версии, предоставляемая всем клиентам. Об этом важно знать всем, у кого уже есть секвенатор Ion GeneStudio S5: они могут попробовать применять предлагаемое решение по анализу. Все, что нужно – это реагенты All Species ID для детекции видов мяса. рыбы и растений, и данная программа. Поставщик дает ссылку на данную программу на 2-3 недели, чтобы пользователь мог поставить свое исследование и открыть результаты в программе, увидеть, как проходит анализ данных, как выводятся результаты, какие отчеты можно получить, в целом оценить активность и эффективность данной программы, ее преимущества.
С NGS методом можно детектировать все мишени в одном запуске, загрузив на чип образцы и мяса, и рыбы, и растительной продукции. Для каждого набора получается по 48 образцов – в итоге можно собрать в одном чипе для запуска 48 образцов мяса, рыбы и растении.
Следует отметить, что ДНК может быть сильно фрагментированной в обработанных пищевых образцах типа рафинированного масла, тушенки, сгущенки и других продуктов, но наборы позволяют работать и с такими образцами.
Немаловажен момент внедрения нормативных документов нормативных документов по данному виду тестирования. NGS внедряется в международную стандартизацию; готов к выходу стандарт ISO по выявлению фальсификации в пищевой продукции методом NGS. Выход этого стандарта несколько задержался из-за ситуации с коронавирусом и состоялся в октябре 2021 г., и после публикации европейского стандарта ISO можно говорить также о переводе его на русский язык и о каких-то внедрениях в России, позволяющих сделать такое тестирование уже более глобальным, общепринятым, обоснованным и популярным и у нас.
Итак, SureTect и ПЦР существенно ускоряют исследования и позволяют получить больше информации по детекции патогенов, а NGS секвенирование для выявления фальсификации пищевых продуктов помогает достичь уверенности в используемом сырье и отсутствии фальсификации пищевой продукции, что немаловажно для самих производителей.
Возникают вопросы, насколько просчитывается стоимость различных вариантов анализа: для рутинных экспериментов стоимость важна и присутствует понимание, что классические методы всегда окажутся дешевле, чем экспресс-методы. А есть ли понимание у производителя о том, чтобы регулировать стоимость своего оборудования и способствовать снижению себестоимости анализов? Конечно, да: Thermo FS проявляет готовность так или иначе оптимизировать свои решения для повышения их доступности и удобства. Это всегда можно обсудить с представителями «Диаэм» в индивидуальном порядке, всем заинтересованным будет продемонстрировано оборудование, а кроме того – предоставлен необходимый обширный методический материал.
Следует отметить, что необходимо учитывать при сравнении не только цену оборудования и реагентов, но и трудоемкость процессов: например, если для работы с хромогенной средой используются один бульон, одна чашка и один тест для подтверждения, то в классическом методе требуется несколько бульонов, несколько чашек со средой, больше реагентов.
В первой части вебинара речь шла о важности эргономики, логики и достижениях биохимии.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
