История
История
Содержание статьи:
ThermoFS предлагает для секвенирования NGS современный прибор Ion Torrent Genexus", для которого сейчас доступен чип, способный за один пробег получить до 60 млн прочтений.
Особенности этого чипа в том, что он состоит из четырех линий, а каждая из них работает независимо. Можно запускать только одну из них, и она дает 12-15 миллионов прочтений. Соответственно при использовании всего чипа на этом приборе доступны результаты до 60 млн прочтений за один запуск.
Весь чип суммарно «читается» 30 часов. Если использовать только одну линию, процесс сократится до 24 часов. В целом скорость работы прибора зависит от количества образцов и используемых линий.
Секвенирование на Genexus может быть таргетным или полногеномным. Таргетное секвенирование позволяет читать только участки генома, которые интересны пользователю – только мишени, которые имеют для него какую-то информационную ценность.
Ресурс AmpliSeq.com содержит инструмент, который позволяет создавать свои собственные таргетные панели под конкретные задачи. Пользователь создает панель под свою задачу либо из готовых решений, либо с нуля. Это можно сделать для любого генома: человека, улитки, винограда, животных, растений, грибов и т.д.
Смысл этой технологии в том, что секвенирование направлено именно на те мишени, которые интересны пользователю: для этого нужно выполнить амплификацию путем реакции ПЦР. И технология AmpliSeq позволяет подбирать праймеры к любым выбранным мишеням. Примечательно, что все эти праймеры будут работать в одной пробирке. Высокомультиплексная технология AmpliSeq позволяет в одной пробирке комбинировать до 12,5 тысяч пар праймеров, то есть в сумме всего до 25 тысяч праймеров. Если подбирать эти праймеры вручную, максимальное их число – около 30.
Итак, изначально пользователю доступна ДНК или РНК. Если у нас РНК, ее с помощью обратной транскрипции переводят в кДНК. После этого нужно амплифицировать мишени, которые в результате требуется прочитать.
После их амплификации к мишеням нужно «пришить» адаптеры, или индексы и адаптеры, и отправить на сиквенс.
Для подбора праймеров и создания собственных панелей нужно воспользоваться сайтом AmpliSeq.com, очень простым в использовании начиная со стадии регистрации.
Уже на главной страничке после авторизации можно начинать создавать свою панель. Здесь есть несколько разделов. Начнем с самого простого: можно создавать свои панели, можно использовать готовые. Одна панель позволяет секвенировать какие-то конкретные гены.Есть 70 фиксированных панелей, позволяющие просеквенировать определенные гены. Они сгруппированы по областям применения: эти области можно кликать, смотреть, что где доступно, фильтровать с использованием расположенных слева фильтров по тому, с каким типом исходного материала работают, с каким геномом и так далее.
Например, существует панель на первичные иммунодефициты: она содержит справочную техническую информацию, позволяющую понять, что входит в эту панель, какие гены. Каждый ген можно открыть в визуальном браузере и посмотреть его расположение на геноме. Также можно посмотреть характеристику данной панели: сколько ампликонов секвенируется и читается в рамках этой панели. Например, здесь 5000 ампликонов – индивидуальных последовательностей, которые в результате можно прочитать. Какая средняя длина прочтения? Примерно 200 пар оснований. Можно узнать среднее покрытие, количество необходимых нанограммов исходного материала, сколько образцов можно мультиплексировать на один чип и на какой именно.
Отдельная группа панелей носит название Oncomine – это торговое название панелей для онкологических исследований. В их перечне можно кликнуть на какую-либо панель и посмотреть, что предлагают пользователю увидеть на этом сайте. А есть в данном случае перечень генов, РНК и ДНК, которые входят в состав панели, различная техническая информация, количества праймеров, ампликонов и генов, какие и где можно посмотреть. А еще информация об их визуальном восприятии, синонимах этих генов, их участии в каких-либо других заболеваниях. По каждой панели такой справочной информации очень много.
Если панель создается с нуля, начинаем с панели OnDemand. Внутри AmpliSeq.com есть готовая база данных всех дизайнов праймеров к человеческим генам – доступен дизайн праймеров более чем к 5000 генов!
Есть и второй вариант – это просто ввести данные в текстовом формате или специальном формате AmpliSeq с перечнем того, что интересует пользователя – система понимает и этот формат.
А если пользователь не знает, какие гены хочет исследовать, но знает, какое заболевание хочет исследовать?
В таком случае нажимаем на кнопку и дальше исходя от заболевания, которое нужно исследовать, конкретизируем его. Например, мы выбираем группу «Заболевания сердца» – дальше конкретизируем, выбирая из предложенных списков и за несколько шагов добираемся до того, что программное обеспечение показывает список всех генов, которые в его базе данных связаны с данным заболеванием.
Особенности этих панелей в том, что они рассчитаны только на человеческий геном.
А если референсный ген не человеческий, а скажем, винограда?
Тогда нужно прибегать уже к панелям Custom – то есть создавать панель с нуля на любой геном. Это делается так.
Существует определенное количество референсных геномов, которые уже встроены в это программное обеспечение. Но если искомого референсного генома нет, следует выбрать CustomDesign и загрузить туда этот референсный геном, например, скачав его с сайта NCBI. Дальше нужно указать координаты искомых мишеней, которые нужно просеквенировать. Координаты можно указывать, набивая их в строке или подгрузив в файле, который откроется в текстовом редакторе либо vcf. Там должны быть координаты хромосомы, начала и конца. И программа подбирает исходя из этих данных дизайн праймеров к указанным мишеням.
Эта технология позволяет работать как с внеклеточной ДНК, так и с FFPE блоками, так и с РНК.
О чем следует помнить пользователям
В России, чтобы официально производить какую-то диагностику, нужно получать регистрационное удостоверение, но его имеют не все приборы. Например, панель AmpliSeq его не имеет. А европейские системы удостоверений для РФ не применимы.
Что касается полногеномного сиквенса человека, это технически возможно. Но остается вопрос: действительно ли есть потребность у исследователя в таком количестве информации? Данные секвенирования NGS – это огромный массив информации. Исследователю скорее всего будут интересны только некие определенные области мишеней, которые уже изучены или о которых исследователю известно. Действительно ли есть потребность в анализе неинформативных регионов? Все зависит от целей исследования: нужен ли полный геном, полный экзом, или таргетное секвенирование окажется быстрее и дешевле? Это вопрос целей и стоимости исследования.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
