История
История
Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание второй части вебинара «Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики», состоявшегося 20 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Специалист «Диаэм» в области молекулярной генетики и смежных дисциплин Николай Байбаев рассказал о новинках рынка приборов и материалов для молекулярной биологии и генетики и о том, чем можно заменить в актуальных быстро меняющихся условиях продукцию, с которой российские исследователи привыкли работать раньше. Этот вебинар автор посвятил капиллярным секвенаторам и секвенированию NGS. Во второй части «Секвенирование нуклеиновых кислот: с чем работать генетику в новых условиях» Николай остановился на актуальных новинках аппаратного обеспечения и расходных материалов для таких исследований.
Итак, какие же решения появились сейчас и остались доступными в области капиллярных секвенаторов и секвенирования NGS?
Начать стоит с места в генетике, которое занимают капиллярное секвенирование, капиллярный электрофорез и NGS.
Рутинный анализ в этой области в основном проводится методами количественного ПЦР и реалтайм-ПЦР.
Это подтверждение гипотез – как раз та область, для которой актуален капиллярный электрофорез и в меньшей степени микрочипы (потому что, во-первых, сейчас чипы очень дороги, во-вторых – они стали труднодоступными).
А NGS – это в настоящее время верх совершенства, крайне востребованный в поиске нового. Потом результаты таких исследований приходится подтверждать либо капиллярным электрофорезом (он же CE), либо «реалтаймом», кто как может – дело в том, что ни одна технология не предназначена для решения всех задач, так что часто приходится совмещать разные подходы.
Она, как было рассказано в первой части вебинара при рассмотрении приборов Qcep, подразумевает движение фрагментов ДНК от катода к аноду и детекцию, как правило, флуоресцентного свечения при помощи лазера.
Капиллярные генетические анализаторы в целом выполняют две функции: секвенирование по Сэнгеру и фрагментный анализ нуклеиновых кислот.
Из преимуществ именно таких приборов следует отметить точность детекции. Разрешение в один нуклеотид в них поддерживается стопроцентно, а в целом, например, при определении относительных размеров длин фрагментов во фрагментном анализе прибор рассчитывает длину «до сотых нуклеотида», что по физическому смыслу звучит как абсурд и в реальности так не бывает, но точность такого уровня при расчетах действительно обеспечивается.
Секвенирование по Сэнгеру многим знакомо на практике: это определение последовательности в небольшом неизвестном участке, ограниченном двумя праймерами. Весь процесс занимает 8-9 часов от выделения ДНК, потом проведение ПЦР и очистка ее продуктов, потом вторая ПЦР – сам сиквенс с одним праймером, очистка от непрореагировавших продуктов этого полученного секвенированного продукта и последующий «разгон» его на с помощью электрофореза и получение электрофореграммы, где в «гребенке» каждым цветом при процессе «обращения к базе» (base-calling) определяется нуклеотид, соответствующий данному пику.(Рис. 1)
Что такое фрагментный анализ: это опять же разделение фрагментов, но с учетом определения их относительных длин. Одно из отличий фрагментного анализа от секвенирования – это использование двух пар праймеров, а при секвенировании используется одна – непосредственно после ПЦР. Здесь же идет только ПЦР с двумя парами праймеров, один из которых метится флуорофором. Одновременно с целевыми фрагментами в лунку с образцом вносится размерный стандарт – набор фрагментов известной длины, которые разгоняются одновременно с образцом и на основании их миграции происходит относительное определение длины пользовательских целевых фрагментов.
Рабочий процесс в этом случае покороче ввиду того, что включает только один этап ПЦР, кроме того – часто при фрагментном анализе можно пренебречь этапами очистки, если есть достаточно читаемый образец. Иногда его нет, и тогда приходится проводить доочистку того, который есть в распоряжении, но это увеличение продолжительности при этом не критично.
Они известны: секвенирование (и не только оно) решает задачи онкологии, фрагментный анализ задействован в генотипировании (SNP) для онкологических исследований, связанных с микросателлитной нестабильностью – такие исследования набирают популярность.
Востребованы эти методы в изучении различных заболеваний – моногенных и других, в задачах, касающихся репродуктивного здоровья для исследования различных мутаций – это опять же делают и методом Сэнгера, и используя фрагментный анализ.
Следующая область – генотипирование: STR, SNP, используемые в генотипировании микробов, клеточных линий: это не совсем актуально в России, но и у нас приходится многим подтверждать происхождение, проводить аутентификацию своих клеточных линий. Кроме того, методы востребованы в генотипировании животных по STR и SNP, в генотипировании человека по STR (по SNP менее распространено, так как для идентификации это используется, но нужно слишком много «снипов», по STR генотипирование более популярно).
На слайде: области применения сэнгеровского секвенирования. Секвенирование одного гена востребовано в онкологии (где также применяют и тестирование на панелях с малым количеством генов, и NGS подтверждение, и валидацию клонов, а также разновидности фрагментного анализа: MLPA, исследование микросателлитной нестабильности, SNP генотипирование), изучении наследственных заболеваний (здесь также полезны малые генетические панели, NGS, MLPA, анализ микросателлитной нестабильности и ПЦР с использованием праймеров, специфичных к повторам, SNP), идентификации микроорганизмов (для этого также используют малые панели генов и STR генотипирование), подтверждении результатов геномного редактирования (здесь же полезна валидация клонов) и в агрогеномике (в ней же востребованы малые генетические панели, STR- и SNP- генотипирование). Кроме того, методы на основе сэнгеровского секвенирования и фрагментного анализа используются в изучении репродуктивного здоровья (малые генетические панели, NGS, ПЦР с использованием праймеров, специфичных к повторам, работе с плазмидами (валидация клонов, MLPA), аутентификации клеточных линий и человека (здесь помогает только STR генотипирование).
Отвечая на вопрос «Как было?», то есть «На чем работала и сейчас продолжает работает вся Россия?», казалось бы, нужно ответить «на капиллярных секвенаторах AppliedBiosystems», кроме которых вроде бы ничего и не было.
Традиционно используемые приборы для капиллярного секвенирования: SeqStudio (4 капилляра), 3500 (8), 3500XL (24), 3730 (48) и 3730XL (96), обновленный 3730 (48/96). С ростом производительности прибора растет и цена.
Сегодня уже нет старых приборов типа 3130, они давно не производятся; были 3500 и 3500XL по 8 и 24 капилляра, далее – таких приборов буквально 1-2 в стране – 3730 на большое количество образцов. Несколько лет назад появился небольшой секвенатор SeqStudio – компактный удобный, который также очень неплохо зашел и его поставили в большое количество лабораторий, которым неважна была высокая производительность.
Но на рынок начали выходить новинки.
Так, появился российский «Нанофор 05», хотя этих приборов было не так много. Пока эта продукция от компании «Синтол» – буквально все, на что наши исследователи могут рассчитывать.
Следует отметить, что «Нанофор» за последние 2 года улучшился, в нем много что обновлено, он стал лучше и вполне начал удовлетворять потребности пользователей, об этом говорит его растущая популярность.
Основные плюсы «Нанофора 05»:
Кроме того, «Нанофор» открыт для расходных материалов от различных производителей в отличие от систем 3500. У него нет привязки к RFID, поэтому расходные можно использовать любые: полимеры, буферы, о капиллярах заранее сказать трудно, например, «примет» ли он капилляры от 3130 – надо пробовать. Но поскольку нет привязки к RFID метке, то главное – чтобы комплектующие и расходные подходили по техническим характеристикам.
У «Нанофора» семь флуоресцентных каналов. Пока это их уникальная особенность, «фишка», но она мало где будет использоваться, потому что мультиплекс в России делают в основном на шести каналах, то есть это преимущество, но пока не столь полезное.
«Нанофор» пока однопланшетный: это нельзя назвать недостатком, но это его особенность в сравнении с оборудованием, которое рассматривается ниже. Это ограничивает его производительность: придется менять плашку после прогона, у других же можно поставить за 1 раз два планшета.
В настоящее время начата работа с новым производителем генетических анализаторов из Китая – HealthGeneTechnologies, у которых есть своя линейка капиллярных секвенаторов.
Среди приборов HealthGeneTechnologies есть, например, 8A Genetic Analyser – это небольшой 8-капиллярный генетический анализатор, имеющий спектральную калибровку по 4-6 каналам. В нем установлен точно такой же твердотельный лазер, как у приборов AppliedBiosystems – на 505 нм.
В отличие от «Нанофора», китайские машины, с которыми начала работать «Диаэм», все имеют по 2 планшета с загрузкой по 96 образцов (по 0.2 мл) каждый.
В комплекте с ними также поставляется ПО для вторичного анализа данных.
Эти приборы открыты для расходных материалов от разных производителей – у них тоже нет привязки к RFID-меткам.
По состоянию на октябрь 2022 г. оставалась небольшая недоработка: в ПО у таких анализаторов полностью работал модуль фрагментного анализа, но модуль для секвенирования по Сэнгеру не работал, но его доработка и запуск планировалась к ноябрю 2022. С таким модулем машины от HealthGeneTechnologies можно считать полностью функциональными и полноценными.
Также у этого производителя есть серия G (и GA) – это 8-, 16- и 24-капиллярные машины. В целом они мало отличаются от прибора 8A, в них есть все то же самое, они рассчитаны на 2 планшета по 96 образцов (по 0.2 мл) каждый. Но у этой серии другой, более мощный лазер. Кроме того, хотя пока в характеристиках указывается 6 красок, но уже есть информация, что они будут работать с количеством красок до 8 красок. Неизвестно, кому понадобится мультиплекс на 8 красителях, но при необходимости его можно будет реализовать. Например, в Китае это востребовано в наборах для судебной медицины, там специалисты проводят идентификацию уже по 40 локусам, и это повышает дискриминационный потенциал набора. В России пока нет этого, но когда такая возможность появится, ей наверняка найдут применение.
Внутри у этих приборов – кстати, как и у «Нанофора» – такая же стандартная схема, как у приборов Applied Biosystems 3130: присутствует полимерный блок, есть анодный буфер, баночка с полимером, печь, капилляры, автосэмплер для двух планшетов и буферов. Никакой RFID идентификации для расходных материалов нет: можно менять и ставить такие расходные, какие есть в распоряжении у лаборатории.
«Диаэм» продолжаем поставлять расходные материалы к секвенаторам AppliedBiosystems: оригинальные к серии 3500, к SeqStudio; с более старыми моделями сложно, потому что расходные к ним производятся в США и их собирались снять с производства к концу 2022 г.
Появились неплохие расходные российского производства от «Синтола» – например, капилляры для «Нанофора», полимеры, формамид и буферы, которые можно использовать на разных приборах, не только на «Нанофоре», но даже на приборах серии 3500. Не так давно автор доклада лично убедился в возможности проводить фрагментный анализ на полимере ПДМА-4 от «Синтола» на SeqStudio. В целом результаты получены удовлетворительные. Некоторые затруднения вызывает валидация, поскольку полимеры SeqStudio и ПДМА-4 имеют некоторые различия.
«Диаэм» предлагает септы – один из важных расходных материалов, значение которых многие недооценивают. Оригинальные септы AppliedBiosystems всегда стоили очень дорого, потому что они очень мягкие, иглы капилляра через них проходят легко и непринужденно. Сейчас ассортимент пополнился отечественными септами от партнеров из Новосибирска, у них эта продукция появилась недавно. Есть септы для планшета, для буферов – например, у «Нанофора» или у катодного буфера SeqStudio можно их использовать, есть и септы катодного буфера 3500.
Кроме того, появились интересные решения, которые бывают иногда полезны. Одно из таких – это отрывная септа: если пользователь не ставит весь планшет, он может оторвали столько рядков, сколько нужно, закрыть и поставить форез. В ассортименте также есть септы-стрипы и одиночные септы на случай, если нужно переставить буквально 1-2 образца: их закрывают маленькими одиночными септами.
«Диаэм» по-прежнему поставляет оригинальные наборы от Applied Biosystems, а также аналог набор для циклического секвенирования по Сэнгеру NovaDye Terminator.
Кроме того, на российский рынок вышли наборы GenSeq, которые производит «Синтол». Они представляют собой аналоги BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и поставляются в фасовках на 24, 100, 1000 и 5000 реакций. В дополнение к нему созданы и наборы для очистки реакций секвенирования XTERM, и набор для циклического секвенирования по Сэнгеру NovaDye Terminator.
Для фрагментного анализа в наличии есть спектральные калибровки на 5-7 красителей и различные размерные стандарты.
Поговорим о решениях для секвенирования NGS, которые пришли в Россию недавно и начинают набирать обороты.
Возможно, все специалисты привыкли, что «NGS – это Illumina,Thermo FS (Ion Torrent)». Ну, в крайнем случае – MGI, набирающий популярности на российском рынке.
Но в 2021-м появился новый китайский секвенатор от GeneMind – группы ученых, которые прежде работали в MGI и впоследствии отделились от этой компании, стали работать самостоятельно и создали секвенатор, который начинает успешно конкурировать с машинами MGI.
Называется он GenoLab M: это высокопроизводительная система, максимальная производительность которой составляет 150 гигабаз за запуск.
Он довольно внушителен по габаритам (1200 х 685 х 595 мм) – весит около 280 кг; впрочем, и другие китайские машины от MGI тоже некомпактные, большие.
Можно рассмотреть основные детали в устройстве этого секвенатора: отсек для проточных ячеек, куда можно загрузить две проточные ячейки на каждый запуск; отсек для реагентов, то есть картриджи для секвенирования с нуклеотидами и с химией перед промывкой, и так далее.
Технология секвенирования GenoLab M ничем не отличается от Illumina, но у этого производителя она запатентована под названием SURF-seqTM. Секвенирование осуществляется с использованием четырех меченых разными флуорофорами нуклеотидов, 3`-конец которых заблокирован (обратимые терминаторы).
Преимущество технологии в том, что GenoLab M может работать с любыми библиотеками, которые совместимы с платформой Illumina – от различных производителей. Итак, все, что секвенируется на Illumina, может секвенироваться и на GenoLab M.
Основные параметры устройства: две проточные ячейки, максимальное количество прочтений – 500 млн, общий выход – 150 гигабаз, длина прочтений может быть разная в зависимости от того, какая библиотека подготовлена. На слайде указано значение 50, но при необходимости с определенным набором можно достичь и длины 25 (по мнению автора).
Общее время секвенирования такое же, как на Illumina – от половины до 2 суток, качество данных (более 80%, более Q30) и точность (более 99%) сравнимы.
От производителей прозвучало обещание к концу 2022 г. увеличить производительность этого прибора от GeneMind до 300 гигабаз путем обновления программного обеспечения. В результате приборы будут совместимы с новой версией проточных ячеек, которая даст такой выход.
GenoLab M совместим с основными протоколами для секвенирования NGS.
Можно посмотреть, для каких протоколов допустимо его использование:(Рис. 2)
Области применения прибора и технологии понятны: они типичные для NGS, для многих это вошло в практику. Здесь приведены некоторые примеры применения и указан режим секвенирования, который при этом использовался на GenoLab M.
В исследовании репродуктивного здоровья: неинвазивный пренатальный тест (НИПТ), исследование вариации числа копий генов (CNV), преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). В качестве образца используется периферическая кровь матери, режим секвенирования – SE50 + баркоды + индексы.
В выявлении инфекций: метагеномное детектирование патогенных микроорганизмов, выявление возбудителей лихорадки неясного генеза, выявление генов лекарственной устойчивости. Тип образца: бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), режим секвенирования: SE75 + индексы + баркоды.
В выявлении генетических заболеваний: выявление болезней моногенного наследования, обнаружение гена чувствительности к лекарственным препаратам у детей, обнаружение гена талассемии, глухоты. В качестве образца используется периферическая кровь, режим секвенирования: PE150 + индексы + баркоды.
В онкогенетике: обнаружение генов, отвечающих за наследственные опухолевые синдромы, сопутствующая диагностика, ранний скрининг опухолей. В качестве образца необходима ткань, режим секвенирования – PE150 + баркоды.
Может поддерживаться как одноконцевое, так и парноконцевое прочтение (как и в Illumina).
Некоторые ключевые преимущества этого оборудования:
Публикации с использованием данных, полученных на GenoLab M, уже доступны, их примеры приведены на этом слайде:
Кроме того, недавно в Томском НИМЦ было проведено исследование на платформе 10X Genomics РНК единичных клеток. Сравнительное секвенирование осуществили на GenoLab M и на NextSeq 2000 Sequencing System от Illumina. Результаты в целом оказались сравнимы, и GenoLab M, который недавно появился в институте онкологии, в Томском НИМЦ, дал результаты нисколько не хуже, чем прибор от Illumina.
Такие же приборы появились и опробованы в московских лабораториях «Геномеда», недавно поставили еще один GenoLab M в Альметьевский нефтяной институт – там будут проводиться исследования микроорганизмов, их секвенирование. Так что GenoLab M уверенно набирает обороты.
«Диаэм» предлагает хими. для библиотек от китайского производителя Vazyme Biotech.
У Vazyme большой ассортимент такой продукции для различных платформ: есть наборы Illumina, MGI, наборы для Ion Torrent от ThermoFS, конечно же, для GeneMind с учетом того, что туда подходит «иллюминовская» химия – то есть для GenoLab M.
Кроме наборов, у них существуют свои адаптеры, индексы под каждый набор, наборы для секвенирования, для подготовки библиотек – есть для ДНК, для РНК, для секвенирования единичных клеток. Кроме того, у производителя есть разделение наборов с ферментативным либо ультразвуковым фрагментированием, и для наборов с ферментативным – необходимые ферменты уже включены в комплект. Это все доступно в «Диаэм».
Кроме наборов для библиотек, у этого производителя есть неплохие частицы для очистки и селективного отбора по размеру, аналогичные частицам AMPure XP от Beckman Coulter. Предлагается два варианта: набор для очистки ДНК и селективного отбора VAHTS DNA Clean Beads N411 и набор – для концентрирования и деплеции рибосомальной РНК, то есть для очистки РНК VAHTS RNA Clean Beads N412.(Рис. 3)
Еще один вид реактивов от VazymeBiotech для библиотек NGS – это набор для квантификации библиотек, представленный в двух вариантах:
- для квантификации на флуориметрах, в том числе на Qubit – наборы Equalbit 1x dsDNA HS Assay Kit EQ121 (High Sensitivity), Equalbit RNA HS/BR Assay Kit EQ211 & EQ 212 (High Sensitivity / (Broad-Range) – все привычно, как было у ThermoFS для его Qubit.
- для квантификации на амплификаторах в реальном времени: здесь есть VAHTS Library Quantification Kit for Illumina NQ101, кроме того – к нему имеется набор стандартов VAHTS Library Quantification Kit for Illumina DNA Standard 1-6 NQ105 и буфер для разведения библиотеки Library Dilution Buffer NQ106.
Итак, все необходимое для квантификации путем «реалтайма», у Vazyme есть и можно эти реактивы привезти.
Дополнительные вопросы по оборудованию и расходным материалам для генетических исследований можно задать по телефону +7-927-880-36-76 или электронной почте nba@dia-m.ru.
Новость о вебинаре «Генетический анализ – доступные инструменты для молекулярной генетики»
Другие части вебинара:
Ссылка на вебинар «Биоанализаторы Qsep – предварительный анализ нуклеиновых кислот и не только».
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
