История
История
Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание первой части вебинара «Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики», состоявшегося 20 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Специалист «Диаэм» в области молекулярной генетики и смежных дисциплин Николай Байбаев рассказал о новинках рынка приборов и материалов для молекулярной биологии и генетики и о том, чем можно заменить в актуальных быстро меняющихся условиях продукцию, с которой российские исследователи привыкли работать раньше. Этот вебинар автор посвятил в основном системам электрофореза и секвенирования NGS. В первой части «Биоанализаторы Qsep: предварительный анализ нуклеиновых кислот и не только» Николай остановился на семействе приборов Qsep.
В первую очередь эти приборы применяются для фрагментного анализа нуклеиновых кислот. Для чего это нужно? Такие задачи можно разделить на две группы.
К первой группе – предварительному анализу нуклеиновых кислот – относятся вспомогательные методы, необходимые для оценки чаще всего нуклеиновых кислот перед другими работами. В числе таких можно назвать
Вторая группа объединяет самостоятельные методы генетического анализа. Наиболее интересные из них:
Большая группа задач, для которых используются приборы Qsep – это анализ нуклеиновых кислот перед использованием других способов их исследования на концентрацию, фрагментированность, наличие примесей и ингибиторов ПЦР.
Решать эту задачу можно очень многими различными способами, все они указаны на слайде вместе с известными преимуществами и недостатками:
Исследователи давно знают, что чаще всего для оценки нуклеиновых кислот применялись и применяются приборы Agilent: например, на слайде слева показан Bioanalyzer 2100, справа – улучшенные машины TapeStation, к которым все специалисты привыкли и считают их стандартом качества.
Но в актуальных условиях и с поставками техники Agilent есть определенные сложности, и дороговизна самих приборов и расходных материалов к ним приобретает особую значимость.
Поэтому уже много лет «Диаэм» предлагает своим клиентам альтернативу под названием Qsep. (Рис. 1)
Фрагментный анализатор Qsep – это прибор, который объединяет в себе гель-электрофорез, частично спектрофотометр (за исключением того, что чистоту исследуемого образца и наличие каких-то примесей он не покажет) и флуориметр. Если нет возможности или желания использовать в лаборатории несколько приборов, можно заменить их фрагментным анализатором Qsep. Большинство задач он решает. (Рис. 2)
Это продукция фирмы BiOptic, расположенной в Тайване; проблем с поставками у них нет, и они успешно поставляют в Россию приборы и расходные материалы.
Компания предлагает несколько семейств приборов, которые различаются по своим характеристикам.
Первая – Qsep1. Это три небольшие машины, между которыми есть небольшие отличия.
Например, Qsep1-Lite отличается от Qsep1 и Qsep1-Plus большей простотой программного обеспечения: у этого устройства нет возможности редактирования протоколов электрофореза. Самим производителем Qsep1-Lite позиционируется как «форезник» для учебных целей, то есть для того, чтобы пользователь взял картридж, «заточенный» под один метод, открыл в программном обеспечении предназначенный для него протокол, запустил его и получил результат. Отредактировать такой протокол под какие-то свои нужды в этом приборе нельзя.
У остальных приборов семейства эта возможность есть, они обладают полным функционалом. Qsep1 и Qsep1-Plus – это небольшие машины, максимальная загрузка для которых достигает 15 образцов за прогон.
Далее производительность растет.
В прибор Qsep100 можно поставить 96-луночный планшет и запустить электрофорез до 96 образцов в одном прогоне. Но это не значит, что туда нужно непременно ставить полную плашку. Прибор действует по принципу «один прогон – один образец», поэтому можно поставить хоть один, хоть 10, произвольное количество до 96, при этом перерасхода материалов для электрофореза (в частности, полимера, в котором происходит электрофорез) не будет.
И Qsep400 – прибор, в который можно загрузить планшет, но у него 4 капилляра, так что следует учесть ограничение: желательно ставить количество образцов, кратное четырем.
Характеристики устройств отображены на слайде: возможность проанализировать от 1 до 96 образцов, чувствительность определения – от 5 пг/мкл, продолжительность анализа – 2-7 минут на 1 образец, стоимость – от 1000000 рублей. С учетом того, что гель расходуется всегда только на целевой образец, и с учетом очень дешевых расходных материалов себестоимость анализа получается 0,5 доллара США за образец.
Расчеты показывают: если в качестве расходного материала брать упаковку из двух картриджей для самой рутинной работы, например самые простые картриджи S2, подходящие для очень большого количества применений (в том числе скрининга ПЦР и оценки библиотек), то 2 картриджа по 200 запусков вместе со всей химией к нему (маркерами и буферами) обойдутся пользователю в сумму порядка 10 тысяч рублей, то есть анализ одного образца будет иметь себестоимость 25 рублей – это очень неплохо.
В принципе действия капиллярного фореза нет ничего сложного: катодный конец, анодный, есть буфер, внутри картриджа находится полимер – скорее всего это обычный полиакриламидный гель, в котором уже имеется интеркалирующий краситель. При движении нуклеиновой кислоты от катода к аноду интеркалирующий краситель встраивается во фрагменты, в определенный момент проходит окно детекции, где его свечение детектируется. Все это происходит без денатурации.
Вот так выглядит картридж: отмечено место, где происходит детекция, внутри капилляр – игла, полимер поршнем проталкивается каждый раз при новом электрофорезе внутрь.
Первая стадия – проталкивание поршнем нового полимера внутрь капилляра: остатки старого фореза при этом уходят в промывочную емкость с водой.
Далее идет стадия забор образца путем электрокинетической инжекции.
Потом конец опускается в форезный буфер, подается напряжение, фрагменты начинают движение в геле и в определенный момент детектируется свечение. Результат детекции выводится в виде электрофореграммы, изображенной на слайде.
В этих семействах приборов есть модели с небольшим количеством образцов, которые можно загрузить, и побольше – до 96.
Основные различия заключаются в количестве загружаемых образцов и типе адаптера, который могут использовать эти приборы.
Если брать модель Qsep1, которая была до недавнего времени практически единственной в своем роде, так как других не было – она могла использовать два вида адаптеров: на 4 образца (туда, где метки S1-S4, ставят 4 образца или 3 образца и леддер (ladder, маркер длины) – в лунку L/S4) если он необходим, а в остальные лунки ставятся маркеры, вода и буфер). Можно было также использовать адаптер, в который ставят до 8 образцов и вспомогательную химию.
В два описанных адаптера можно ставить неспецифичный пластик: с первым адаптером совместимы пробирки на 0.2 мл, пробирки на 0.1 и 0.2 мл; для второго – стрипы по 4 пробирки от производителя на 0.1 мл (С104252);
Более новая модель Qsep1-Plus может использовать оба этих адаптера, но для него также доступна возможность использования специального адаптера под специфический пластик, в который можно ставить до 15 образцов – пробирки С104254 в стрипах 0.1 мл, 1×16+3 для образцов до 10 мкл.
Кроме того, что у него специальный адаптер, у него есть еще и специальная центрифуга, в которой можно эти стрипы, подходящие к адаптеру, центрифугировать перед форезом.
Для Qsep1-Lite применяется упрощенное программное обеспечение, предлагающее только один протокол для каждого картриджа.
Различия моделей Qsep100 – есть две ходовые модификации, Qsep100 и Qsep100 Advance.
Эти биоанализаторы Qsep можно использовать для анализа не только ДНК, но и белков. Qsep100 работает на длине волны 525 нм, она детектирует белки со спецальным красителем Chromeo P-503, и для этого у приборов имеется специальный «белковый» картридж P1. Детекция флуоресценции у него проводится на длине волны 590 нм.
А модель Qsep100 Advance работает на длине волны 480 нм с белками, меченными красителями ALEXA488 или FITC. Детекция флуоресценции у этой модели – на длине волны 530 нм.
С картриджами серий S и N первая из моделей демонстрирует отличную чувствительность, Advance – хорошую.
Различные испытания показали, что этот вариант намного лучше для работы с белками: система Qsep100 Advance в основном подходит тем, кто работает с белками. Оба прибора могут работать и с нуклеиновыми кислотами, и с белками, но Advance лучше с белками при наличии, что они помечены указанными красителями. А Qsep100 больше пригоден для нуклеиновых кислот.
Так выглядят картриджи для систем Qsep: по 4 капилляра – для Qsep400, для остальных машин используются стандартные одноигольные картриджи.
В упаковке обычно поставляется 2 картриджа на 100-200 прогонов, форезный буфер, минеральное масло для предотвращения испарения образцов, маркеры, пластик – пробирки есть в комплекте.
Картриджи для этих систем подразделяются на качественные и количественные, картриджи для нуклеиновых кислот и для белков.
«Качественные» картриджи имеют такое название только потому, что их основное направление – сам фрагментный анализ, а количественное определение уже вторично, хотя оно и есть – но не такое точное, как в «реалтайме».
В ассортименте есть следующие картриджи: стандартные S2 (номер в каталоге **C405101, C105201 (2 шт.), C105801 (8 шт.), разрешение 4-10 пар оснований), высокого разрешения S1 (номер в каталоге **C405102, C105202 (2 шт.), C105802 (8 шт.), 1-4 пары оснований), для быстрого скрининга F3 (Fast, номер в каталоге **C405103, C105203 (2 шт.), C105803 (8 шт.), с которыми форез идет всего 1-2 минуты (но с разрешением более 50 пар оснований). Также есть высокочувствительные картриджи N1 (номер в каталоге **C405105, C105105 (1 шт.), C105205 (2 шт.)) с количественным нижним порогом до 5 пг/мкл (почти у всех остальных картриджей этот порог 0.1 нг/мкл, исключения составляют картриджи для РНК), но нужно понимать, что при этом придется использовать другой маркер – не тот, который используется с остальными, а специальный маркер для количественного определения (разрешение более 10 пар оснований).
Есть картридж S3 (номер в каталоге **C405106, C105206 (2 шт.), C105806 (8 шт.)) для работы с геномной ДНК, который может работать с выделенными нуклеиновыми кислотами – до 50 килобаз (остальные – до 5 килобаз). И доступен высокочувствительный килобазный картридж N3 (номер в каталоге **C405153, C105153 (1 шт.), C105253 (2 шт.)), характеризуемый чувствительностью 20 пг/мкл. У обоих разрешение 10-50 пар оснований.
Кроме того, в наличии есть специальные наборы – так называемые количественные наборы S2 (номер в каталоге **C405101-Q, C105201-Q (2 шт.), стандартный, 4-10 пар оснований)) и S1 (номер в каталоге **C405102-Q, C105202-Q (2 шт.), высокого разрешения, 1-4 пары оснований), которые уже содержат в себе количественный маркер. Тем самым, используя этот набор, пользователь сможет более точно определять количественные характеристики исследуемых нуклеиновых кислот.
Есть картриджи для анализа РНК (R1 – номер в каталоге **C405110, C105110 (1 шт.), C105210 (2 шт.), C105810 (8 шт.), нижний порог обнаружения 5 рг/мкл, NR1 – номер в каталоге **C405111, C105111 (1 шт.), C105211 (2 шт.), нижний порог обнаружения 1 нг/мкл) и для белков (P2 – номер в каталоге **C405121, C105121 (1 шт.), C105221 (2 шт.)).
Картриджи в основном рассчитаны на 200 запусков (S1, S2 качественные и количественные, килобазный S3), исключения – «быстрый» картридж F3 на 300 запусков и группа картриджей на 100 запусков: N1, N3, R1, NR1 и P2.
Срок годности картриджей F3, N1, N3, R1, NR1, P2 составляет 4 месяца, картриджей S1, S2 (качественных и количественных) и S3 – 6 месяцев.
Все картриджи требуют объем пробы на 1 запуск менее 1 мкл.
Они используются с микропробирками 0.1 и 0.2 мкл, а качественные S1, S2, S3, F3, N3, R1 и NR1 – еще и с микровиалой C104250.
Основные ходовые картриджи – S1 высокого разрешения, S2, килобазные картриджи – это для работы с ДНК.
Если говорить о картриджах высокого разрешения, то сфера их применения такова:
На килобазном картриже производится оценка геномной ДНК, оценка плазмид – опять же до 50 килобаз можно посмотреть.
В нижней части показаны более чувствительные картриджи: их применяют для анализа геномной ДНК, но это пригодится тем, кому нужно точнее оценить количественные характеристики.
Основное предназначение картриджа высокого разрешения N1 – это оценка образцов с низкой концентрацией и образцов внеклеточной ДНК
Картриджи для работы с РНК – их также два, один стандартный для большинства применений анализа РНК, а картридж высокой чувствительности пригодится при низкой концентрации образцов.
О «белковом» картридже понятно, для чего он применим – для исследования белков с чувствительностью 0.5 нг/мкл (по БСА).
Вашему вниманию представлены примеры оценки геномной ДНК на килобазном картридже S3. Можно видеть, что получилось: ДНК хорошего качества, пригодная для дальнейшей работы, виден пик примерно на 7500 и шмер (размытая полоска ДНК, идущая от старта до финиша, фон, на котором бывает трудно увидеть целевые пики), который показывает, в каких пределах находится выделенная ДНК.
По таблице прибор покажет все фрагменты: диапазоны длин, которые он посчитал, их примерные концентрации, можно задать интервал длин, в котором он будет вести подсчет.
Другой пример: по оценке такой же ДНК, но видно, что образец очень сильно фрагментирован, в связи с чем никакой «красоты» не получилось:
Один из примеров анализа библиотек NGS: так оценивали библиотеку перед секвенированием на секвенаторе ThermoFS Ion GeneStudio S5 System, используя картридж S1. Задан интервал в 20 пар нуклеотидов: таблица показывает примерную концентрацию в каждом диапазоне. Видно, что максимум приходится на 290 нуклеотидов с концентрацией 0.34 нг/мкл. (Рис. 3)
Пример анализа целостности РНК: можно увидеть, что в данном случае взята РНК достаточно высокого качества с индексом целостности (у Qsep он называется не RIN, как у Agilent, а RQN, и здесь он близок к 10 (9.83) – принцип расчета тот же, по соотношению пиков 18S и 28S рибосомальной РНК. В данном образце он практически равен 10, это очень хорошее качество. (Рис. 4)
На следующем изображении этот индекс пониже – около 7, и по идее это нужно рассматривать как признак РНК низкого качества. Но недавно, показывая эти результаты в Томске, автор вебинара выяснил, что в принципе специалисты, которые занимаются там исследованием РНК, готовы работать и при наличии РНК с таким индексом – для них это нормально, это дело опыта.
Еще одно из применений – генотипирование. Для примера представлен один из образцов – генотипирование растений по SSR локусам. Это результат, предоставленный из института исследования кормов в Лобне, куда «Диаэм» летом 2022 г. поставила прибор, который успешно начали использовать для решения задач по генотипированию, которые раньше решали путем электрофореза и гель-документирования. Здесь можно видеть аллель длиной 152 нуклеотида, остальные пики отображают праймеры – вывод: это гомозигота.
Еще одно из применений Qsep – электрофорез белков. На представленном приборе это получается лучше, чем обычный форез в полиакриламидных гелях: во-первых, здесь происходят и анализ, и детекция внутри картриджа, во-вторых – происходит автоматическая обработка результата, а результат виден на экране – результаты обработки свечения флуоресценции. Здесь более высокое разрешение, как заявляет производитель, чем это будет при форезе в обычной форезной камере.
Четкая программная обработка анализа результатов делает свое дело. (Рис. 5)
Есть другие примеры электрофореграмм, сделанных на Qsep для определения молекулярных масс различных белков. (Рис. 6)
В комплект поставки прибора входит сам основной агрегат, а также необходимое дополнительное оборудование к нему: воздушная помпа, которая качает воздух через картридж и толкает полимер, стартовый набор стандартных картриджей S1 и S2 – высокого разрешения и рутинный – со всей необходимой химией: буфером, маслом, маркерами – размерными и леддером (ladder).
В комплекте поставки Qsep1 идут адаптеры: у остальных моделей (Qsep100, Qsep400) автосэмплер внутри. Адаптеров у Qsep1 два, у Qsep1-Plus – три.
Можно приобрести полезную опцию – продувочную станцию: случается, что концики при длительном хранении картриджей засыхают, в таком случае их можно продуть и промыть – бывает, что такая процедура помогает.
Если сравнить Qsep с другими машинами, которые использовались ранее или в настоящее время, следует отметить такие моменты.
(В качестве аналогов для сравнения с Qsep100 от BiOptic взяты QIAxcel Advanced от QIAgen и TapeStation System 4200 от Agilent).
Все эти приборы могут работать с количеством образцов до 96. Но, например, у QIAxcel есть неприятный момент: у него 12-игольный картридж, соответственно при постановке меньшего количества образцов пойдет перерасход геля, а значит, нужно брать количество образцов, кратное 12.
Разрешение у Qcep на картриджах S1 явно выше, чем у других моделей. Тем, кому нужно высокое разрешение – например, в том же генотипировании – эти машины больше подходят.
Нижний порог определяемых концентраций при использовании количественного маркера и предназначенных для этого картриджей тоже выше – до 5 пг/мкл.
Qsep действительно не такие скоростные: это связано с тем, что они, кроме последней модели Qsep400, обрабатывают по 1 образцу за форез, но зато они при этом дешевле в сравнении с остальными машинами при всех более или менее сходных с другими параметрах.
Цены на слайде приведены примерные, но разница видна: Qsep почти вдвое дешевле аналога от QIAgen и в 3,33 раза дешевле оборудования от Agilent.
И самое главное – стоимость расходных материалов: как уже упоминалось в начале доклада, при различных рутинных исследованиях порог себестоимости анализа одного образца составляет до 25 рублей.
Если сравнить с аналогичным параметром у Agilent, например, на старом Bioanalyzer, при полной загрузке чипа у него получается стоимость одного образца примерно в десять раз больше.
Дополнительные вопросы по оборудованию и расходным материалам можно задать по телефону +7-927-880-36-76 или электронной почте nba@dia-m.ru.
Новость о вебинаре «Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики»
Другие части вебинара:
Ссылка на вебинар «Секвенирование нуклеиновых кислот: с чем работать генетику в новых условиях»
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
