Флуоресцентная микроскопия

Содержание статьи:

• Немного истории
• Особенности метода
• Как устроен флуоресцентный микроскоп?
• Задачи флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия – это оптический метод исследования объектов, где используется явление люминесценции или свечения. В основе лежит физический процесс, при котором вещество поглощает свет с одной длиной волны, и сразу после этого излучает свет уже с другой длиной волны. Соединения или фрагменты структуры, обладающие такими свойствами, называют флуорофорами.

Немного истории

Явление флуоресценции впервые обнаружил Джон Фредерик Уильям Гершель в 1845 году. Он заметил, что сам по себе бесцветный и прозрачный раствор хинина в солнечном свете излучает насыщенный небесно-голубой цвет. Открытие Гершеля заинтересовало британского учёного Джорджа Габриэля Стокса. Он продолжил исследование и обнаружил, что флуоресцентное излучение (эмиссия) объекта имеет бóльшую длину волны, чем свет, который первоначально возбуждает объект. Разница длин волн максимумов в спектрах поглощения и флуоресценции, открытая Стоксом в 1852 году, называется Стоксов сдвиг.

Первые флуоресцентные микроскопы сконструировали Август Кёлер (1904 год), Карл Райхерт и Оскар Хеймштадт (1911 год), а также Карл Цейсс и Генрих Леман (1913 год). Вначале учёные проводили исследования лишь с веществами, обладающими собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией. К таким веществам относится, например, аминокислота триптофан, входящая в состав большинства белков.

В 1930-х гг. появились первые флуоресцентные метки или зонды для маркировки нефлуоресцирующих объектов. В 1950-х гг. Альберт Кунс и Натан Каплан разработали метод обнаружения антигенов в тканях с использованием антител, меченных флуоресцентными красителями.

Сегодня флуоресцентная микроскопия применяется для решения разных задач, а оборудование и методы сильно превосходят те, с которых всё начиналось. В распоряжении учёных есть микроскопы с высоким разрешением и множество высокоселективных флуоресцентных зондов для маркировки самых разных объектов. (Рекомендуем статью: "Современные методы в генетическом анализе")

Особенности метода

Большинство компонентов клетки бесцветны и не чётко различимы под обычным микроскопом. С этой проблемой успешно справляется флуоресцентная микроскопия. Нужные для изучения структуры выделяют флуоресцентными метками – соединениями, поглощающими свет заданной длиной волны и после короткой задержки излучающими свет с большей длиной волны, чем поглотили. Например, если поглощается ультрафиолетовый свет, то излучаться будет синий свет или свет с ещё бóльшими значениями длин волн (зелёный, жёлтый, красный). Увеличение длины волны связано с тем, что в процессе поглощения-излучения теряется энергия, поэтому испускаемый фотон имеет меньше энергии, чем поглощённый. Чем ближе свет к красной зоне электромагнитного спектра, тем больше значение длины волны и меньше энергия фотонов.

Для каждого флуорофора характерны свои специфические спектры поглощения и излучения в зависимости от структуры молекулы и её окружения.

Флуоресцентная микроскопия превосходит методы исследования, при которых объекты окрашиваются поглощающими свет веществами. При использовании оптических красителей количество поглощённого света незначительно отличается от фона, поэтому получается трудноразличимое изображение с низким контрастом. А при исследовании с помощью флуоресценции можно увидеть даже отдельные макромолекулы. Флуоресцентная микроскопия позволяет избирательно исследовать отдельные компоненты в сложных биомолекулярных комплексах.

Чтобы увидеть расположение только флуоресцирующих объектов, излучаемый свет отсекают от возбуждающего специальным барьерным фильтром. При этом структуры, меченные флуоресцентными зондами, проявляются на чёрном фоне.

Как устроен флуоресцентный микроскоп?

Флуоресцентный микроскоп – это оптический микроскоп, который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к исследованиям в отраженном и поглощённом свете. С его помощью проводят исследования даже очень маленьких объектов размером порядка 5 нм.

Основные элементы флуоресцентного микроскопа:

• Источник света (ртутная, ксеноновая лампы, светодиод, лазер);
• Фильтр возбуждения – полосовой фильтр, который пропускает только длины волн, поглощаемые флуорофором, и минимизирует возбуждение других источников флуоресценции;
• Эмиссионный фильтр – полосовой фильтр, который пропускает только длины волн, излучаемые флуорофором, и блокирует другой нежелательный свет;
• Дихроичное зеркало или тонкоплёночный фильтр – точный цветной фильтр, выборочно пропускающий свет узкого диапазона цветов при отражении других цветов.

За счёт блокировки «лишнего» свечения, в том числе аутофлуоресценции образца и системы, оптические фильтры в флуоресцентном микроскопе дают самый тёмный фон и яркое, контрастное изображение с высоким разрешением.

Задачи флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия применяется для изучения свойств органических и неорганических веществ в материаловедении, биологии, медицине, физике.

Основная область применения – клеточная биология, особенно нейробиология. Флуоресцентная микроскопия позволяет чётко увидеть определённые структуры в клетке, получить количественные и качественные характеристики о взаимодействиях внутри клетки, анализировать морфологию, внутриклеточные физиологические изменения.

Разработано множество флуоресцентных зондов для изучения процессов в ядре, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, синаптических везикулах. Есть зонды, способные связываться с белками или встраиваться в липидные структуры. (Рекомендуем статью: "Современный подход к культивированию микроорганизмов и культур клеток")

С помощью флуоресцентной микроскопии исследуют инфекционные болезни, клетки крови, костный мозг, изучают фоторецепторы сетчатки глаза.

Преимуществами метода считаются высокая чувствительность, возможность комбинировать флуоресцентные зонды и окрашивать разными цветами отдельные объекты в исследуемом образце, одновременно отслеживать несколько типов макромолекул, проводить мультиплексный анализ. Эти подходы используются для изучения строения, функций клеток, организации клеточных структур, подвижности объектов.

К ограничениям флуоресцентной микроскопии относятся потеря способности к флуоресценции или фотообесцвечивание при накоплении повреждений от электронов, возбуждающихся при флуоресценции, а также фототоксичность для некоторых объектов. Для снижения фототоксичности используют лазерные сканирующие микроскопы с нелинейной оптикой, которые возбуждают флуорофоры длинами волн, близкими к инфракрасному свету. Это значительно снижает токсический эффект и увеличивает время проведения исследования.

В современных флуоресцентных микроскопах изображение объекта получают в цифровом формате. Управление фокусировкой, высотой предметного столика, оптикой, фильтрами, детекторами осуществляют при помощи компьютера. Используются технологии оптоэлектроники, при помощи которых можно управлять субклеточными структурами специальными оптическими пинцетами.

Одним из современных вариантов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия с применением лазерных источников света. Её особенность в использовании точечной диафрагмы, которая размещается в плоскости изображения и ограничивает поток фонового рассеянного света. Лазерная конфокальная микроскопия даёт трёхмерное изображение объекта, позволяет изучать структуру, в динамике исследовать развитие клеток и тканей, в том числе живых.

Несмотря на то, что основы для развития современной флуоресцентной микроскопии были заложены более 100 лет назад, интерес к этому быстрому, точному и относительно простому методу сохраняется до сих пор. Он находит широкое применение в разных областях науки и лабораторной диагностики. На протяжении последнего десятилетия ежегодно по исследованию объектов и процессов методом флуоресцентной микроскопии публикуется от 5000 до 10000 научных статей.