История
История
Содержание статьи:
Эта публикация – вторая часть вебинара «Биотехнология: очистка фармацевтических субстанций», состоявшегося 8 декабря 2021 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Дмитрий Казымов, представляющий подразделение Bioproduction от Термо ФС, рассказал о платформе подбора и генерации аффинных лигандов и сорбентов CaptureSelect и уникальных сорбентах Poros.
Bioproduction – одно из 28-ми подразделений компании ThermoFisher Scientific, общая численность сотрудников которой составляет порядка 90 тыс. человек. Сфера деятельности бизнес-группы Bioproduction – взаимодействие с клиентами, которые занимаются производством биопрепаратов на промышленном уровне.
Структура этого подразделения, работавшего на рынке России и стран СНГ, в 2021-м выглядела следующим образом: Дмитрий Казымов представляет его коммерческую часть, а его коллеги – менеджер канала по России Дмитрий Владимиров и менеджер канала по странам СНГ Александр Турлычкин, а также другие сотрудники – оказывают поддержку клиентам по различным направлениям. Например, специалист по техподдержке в области хроматографии и аналитики Роб Осборн работает в Голландии, но поддерживал российское подразделение в 2021-м.
Весь портфель Bioproduction разделен на следующие группы:
- Одноразовые технологии – продукты для культивирования;
- Клеточные продукты и клеточные линии;
- Продукты для хроматографии;
- Твердый пластик, который тоже активно используется в производстве биопрепаратов.
На слайде видно, что эти продуктовые группы практически полностью закрывают процесс производства биопрепаратов от «апстрима» (восходящего потока, характеризуемого значительными вложениями) на разных этапах и до «даунстрима» (получения финального продукта и его розлива).
Решения, о которых идет речь в данном докладе, относятся к сегменту Purification («Очистка»). Они подразделяются на две основные платформы:
- платформа подбора и генерации аффинных лигандов и аффинных сорбентов CaptureSelect – аффинные смолы, в основном используемые на первом этапе хроматографической очистки;
- платформа синтетического основания Poros – это сорбенты на твердом основании, используемые на этапе «полировки».
Если посмотреть на рынок биопрепаратов, то по состоянию на 2020 год в портфеле разработки находилось 6403 биомолекулы различного типа. Большую часть рынка ранее занимали, да и сейчас занимают различные антитела и терапевтические белки. Но в последнее время к ним добавляются и вирусные частицы, нуклеиновые кислоты, фрагменты, клетки – рынок биопрепаратов становится очень разнообразным и широким. И существующие принципы очистки, которые использовались, например, для очистки моноклональных антител, уже не всегда работают хорошо и эффективно в каком-то определенном применении при разработке новых препаратов.
Thermo FS фокусируется на том, чтобы дать клиенту возможность подобрать решение, оптимально подходящее для разработки его продукта, и применить это решение для эффективной очистки.
Вообще портфель продуктов Thermo FS для хроматографии можно разделить на четыре основные группы
Аффинные сорбенты
Применяются для:
Неаффинные сорбенты на основе синтетического основания POROS:
Кастомные (индивидуальные) решения под клиента: в этом случае можно для конкретного продукта разработать аффинные лиганды и «пришить» их к необходимому основанию (это может быть и агароза, и POROS, если возможно)
Четвертый сегмент – это предупакованные колонны небольшого объема (1-5 мл) для скрининга, а также есть продукт, где совсем маленькие количества сорбента упакованы для скрининга широкого, то есть на определенную группу сорбентов. Это наборы ELISA, колонки HPLC (ВЭЖХ), где также используются эти сорбенты, и биотин-конъюгированные лиганды.
CaptureSelect – платформа по подбору аффинных лигандов и созданию аффинных сорбентов.
Аффинная хроматография помогает сократить количество шагов при хроматографической очистке, увеличить выход продукта, сократить время разработки биопроцесса и вывод продукта на рынок, а также сократить затраты, сопутствующие этому.
Если рассмотреть весь процесс очистки в целом, то графики зависимости выхода продукта от количества стадий процесса, показанные справа, отображают эффективность каждого шага хроматографии. Слева можно увидеть эффективность всего процесса в целом. Нетрудно заметить, что если, например, каждый шаг в хроматографии достаточно эффективен и дает выход порядка 85% (голубая линия), то при четырех этапах очистки итоговый выход продукта составит всего порядка 50%. То есть использование большого количества этапов хроматографии существенно снижает выход целевого продукта.
А с использованием аффинной хроматографии можно более специфично на первом этапе «зацепить» целевой продукт и далее в три шага очистить его до необходимой степени чистоты. Поэтому аффинная хроматография и собственно идея портфеля Thermo FS состоит в том, что этот метод наиболее эффективно работает и поэтому всегда есть смысл подобрать аффинный сорбент. Это сократит этап разработки – нужно будет разработать только несколько шагов очистки. Кроме того, это увеличит выход и чистоту продукта на финальной стадии.
Уникальность платформы CaptureSelect состоит в том, что при наличии библиотеки различных лигандов в процессе разработки новых продуктов производится подбор специфических лигандов к тому или иному продукту, который нужно очистить. Далее они «пришиваются» на основание. Обычно это всегда несколько лигандов, которые дальше помогают обеспечить очень высокую специфичность к целевому продукту, например, белку.
Так как лиганды «выращиваются» в искусственных условиях с использованием дрожжевой культуры, то продукт получается полностью не содержащим каких-либо компонентов животного происхождения. И это тоже очень важно для дальнейшего применения в коммерческом процессе, как и возможность мягкой элюции, высокие стабильность и специфичность.
На слайде показано, как аффинная хроматография позволяет при одном этапе очистки получить очень высокий выход целевого продукта. Здесь отображены случаи для фрагментов, аденоассоциированных вирусов и моноклонального антитела. Фактически можно ввести такую методику для всех типов биопродуктов: терапии антителами, белков плазмы или биоаналогичных препаратов, вирусных векторов, вакцин и рекомбинантных белков.
Сначала происходит «пришивка» специфического продукта, далее – промывка, при которой смываются все загрязнения, которые не нужны в финальном продукте, а далее следует элюция – извлечение продукта из сорбента подходящим растворителем. Это позволяет получить продукт очень высокой степени чистоты. (Рис. 1)
Следующая иллюстрация показывает, как происходит разработка специфических сорбентов (для производства терапевтических антител следующего поколения). В зависимости от того или иного домена они работают, проявляя специфичность к тому или иному продукту, который нужно очистить.
Технология CaptureSelect позволяет присоединять к рабочей поверхности сорбентных частиц аффинные лиганды, среди которых белки A и G, биотинилированные функциональные группы, фрагменты антител Fab, Fab2 и другие, а также рекомбинантные белки.
Так, CaptureSelect CH1-XL – это платформа для очистки CH1-XL –содержащих фрагментов Fab и Fab2, а также IgG антител, связывающая домен CH1 и не связывающая легкие цепи.
CaptureSelect KappaXP – решение, разработанное для очистки каппа-содержащих Fab и Fab2-фрагментов, IgG антител, биспецифических антител – связывает домен CL Kappa, характеризуется высокодинамичной связывающей способностью и мягким удалением продукта.
CaptureSelect FcXL – решение для очистки IgA, IgM и IgG антител. Это решения в том числе для Fc-гибридных белков, он связывается по домену CH3 (Fc).
Его новый вариант FcXP – это матрица CaptureSelect FcXL следующего поколения с повышенной связывающей способностью. Она сохранила прежнюю селективность: лиганд «распознает» (связывает) домен CH3 всех подклассов человеческих IgG (IgG1, 2, 3 и 4), характеристики элюирования у нее аналогичны CaptureSelect FcXL, но способность к связыванию превышает 40 г IgG/л.
Итак, сам процесс разработки проходит в несколько этапов; он одинаков как для коммерческих продуктов, так и для каких-либо кастомных (индивидуальных) решений, то есть для решений специфического скрининга.
Существует большая библиотека лигандов, далее проводится их скрининг и подбор на селективность, специфичность, возможность мягкой элюции, стабильность к тем или иным солевым растворам и буферам, которые используются в технологическом процессе.
Далее подбирается несколько смол, на которые эти лиганды «пришиваются», происходит скрининг уже на процессе очистки: как эти основания вместе с лигандами работают уже в конкретном случае.
Далее следует выбор нескольких наиболее многообещающих сорбентов, также проводится их скрининг и оценка в непосредственном процессе, а также производится валидация решения и его внедрение в GMP производства.
Последний этап – это уже подготовка регуляторной документации, выстраивание процесса в промышленном производстве. Это сорбенты, полностью производимые в GMP условиях, и дальше эти сорбенты могут использоваться клиентом для коммерческого производства со всем пакетом документов.
Такие специально разработанные лиганды и сорбенты можно использовать в том числе для аналитических колонок, для процесса контроля качества.
Компания производит специальные ELISA киты (комплекты) для оценки качества производства, то есть продукт полностью готов к коммерческому использованию на производстве.
Иллюстрация всего спектра продуктов, которые сейчас находятся в разработке или которые сейчас доступны из портфеля аффинных сорбентов, показывает в верхней части так называемые Bioprocess продукты, которые уже доступны и их производство налажено в коммерческом (большом) объеме, то есть они присутствуют на рынке, имеют стандартные артикулы и могут быть заказаны в любой момент.
Далее следуют продукты, которые находятся в разработке: они имеют полностью артикулы, но они пока «только для исследовательских целей», то есть это продукты, которые можно использовать в разработке, и если клиенту понадобится продукт, произведенный в условиях GMP для дальнейшего производства, он может заказать этот продукт. В таком случае последует перевод продукта в разряд «биопроцессных», и он получит полный пакет документов по GMP.
Также на иллюстрации отображены проекты, которые сейчас недоступны для клиентов, но находятся в разработке. Если какие-то из этих продуктов интересны, компания может сфокусироваться на них, и при наличии у клиента четкого желания получить этот продукт, развивать его в сжатые сроки – если клиент готов предоставить необходимые объемы закупки и собственно готов взаимодействовать с компанией, работать, давать свой продукт на тестирование и так далее. Это все продукты, которые сейчас находятся в разработке.
Вторая платформа, составляющая портфель хроматографических сорбентов от Thermo FS – это синтетические основания, так называемые основания POROS на сополимере стирола с дивинилбензолом. Это пористые основания, на которые «пришиваются» аффинные лиганды. Кроме того, эти основания используются для ионообменных сорбентов Thermo FS и для сорбентов гидрофобной хроматографии.
POROS позволяет достигать очень высоких скоростей производства и очень высокой специфичности, получать высокие линейные потоки на процессе хроматографии.(Рис. 2)
График слева показывает отличия оснований POROS при увеличении линейной скорости от классических сорбентов на агарозе.
При увеличении линейной скорости происходит рост давления, но он происходит линейно, предсказуемо – и при скоростях до 800 см в час на POROS получается результат, сопоставимый с давлением, которое мы имеем при 300 см в час на традиционных агарозных сорбентах.
Размер самого шарика сорбента составляет 50 микрон, размер его пор – 2000 ангстрем. Подобраны такие характеристики, которые позволяют иметь оптимальную линейную скорость, оптимальную специфичность сорбента и очень успешно работать в промышленных условиях.
На приведенном слайде показано, как меняются собственно хроматограмма, пик в зависимости от увеличения линейной скорости – видно, что пик не размывается, он остается достаточно острым, хотя и снижается немного, но в принципе специфичность остается достаточно высокой.
На маленьких графиках приведено сравнение традиционного сорбента SP Sepharose Fast Flow и POROS 50 micron HS. Получается, что при скорости 300 см в час видны более четкие пики на POROS, менее четкие – на сефарозе. Но при увеличении скорости до 500 см в час второй пик на сефарозе полностью размывается, то есть невозможно разделить два разных продукта, потому что сорбент уже не работает на таких скоростях.
Здесь же показана и специфичность, binding capacity (связывающая способность) сорбентов: и POROS (XQ, HQ50, PI50), и Sepharose Fast Flow – изменение этого параметра с увеличением скорости.
Видно, что для сорбентов POROS этот показатель падает, но очень линейно, очень предсказуемо, а для сефарозы падение значительно больше – и при скоростях около 800 она совершенно не может сравниться с сорбентами POROS. Итак, на малых скоростях у этих сорбентов значения связывающей способности схожие, а по мере увеличения скорости разница заметно возрастает.
На слайде выше (в разделе Решения Thermo FS в области очистки продукции биотехнологий») приведен сформированный на момент подготовки этого доклада портфель сорбентов POROS – не аффинных сорбентов, а именно ионообменных и гидрофобных.
Катионообменные, анионообменные смолы и сорбенты на основе гидрофобного взаимодействия (обращенно-фазовая хроматография) – в любом случае эти решения характеризуются высокой емкостью, отличным разрешением, высокой толерантностью к соли, улучшенными кривыми зависимости скорости потока от давления и могут быть эффективно использованы для очистки белков клетки-хозяина, ДНК, вирусов.
Потенциальные клиенты задают вопросы о том, можно ли применить продукцию Thermo FS в сфере хроматографии для конкретных технологических процессов.
Что можно применить для очистки желатина, получаемого из мясокостного сырья (говядина), от антибиотиков, которые содержатся в сырье и переходят в экстракт вместе с желатином, но должны быть удалены?
Это применение неспецифичное, и для того, чтобы найти решение, нужно конкретизировать тип антибиотиков, которые необходимо «выловить». Передать данные о конкретных веществах, от которых нужно очистить целевой продукт, можно через сотрудников Диаэм. После этого можно проверить, есть ли готовые решения из существующего портфеля Thermo FS или нужно разработать что-то новое в этом направлении.
Есть ли смолы для выделения лактоферрина и лактопероксидазы из творожной и подсырной сыворотки?
Вопрос достаточно специфичный: нужно уточнить у экспертов Thermo FS, есть ли такие разработки и какой сорбент они бы рекомендовали. В ответ на письмо коллегам из Диаэм и можно подобрать конкретный сорбент для таких нужд.
Роб Осборн из Голландии, подключившийся к вебинару, добавил: «Решения для пищевой промышленности – достаточно нетипичный для нас сегмент, в котором сорбенты, конечно же, работают и разработаны, но нужно уточнять у специалистов из технической поддержки, какие похожие решения уже существуют. Важно понимать структуру целевых молекул (идет ли речь о продукте или о загрязнениях, от которых нужно его очистить), чтобы понять, какие готовые решения можно применить для решения новой задачи в неизменном или модифицированном виде. Возможно, что решение состоит в применении анионообменных смол, но это нужно далее обсудить со специалистами по очистке.
Итак, по индивидуальному запросу потенциальный клиент Thermo FS по состоянию на декабрь 2021 г. мог получить не только общую презентацию продукции, но и ответы на специфические вопросы, рекомендации по выбору решений из портфеля компании для конкретных технологических процессов, а также образцы (при необходимости) и техническую поддержку по применению и оптимизации процесса очистки.
Ссылки на остальные части вебинара:
Новость о вебинаре «Биотехнология: очистка фармацевтических субстанций»
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
